WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

cerevisiae, но не влияет на P. pastoris, даже при внутриклеточном накоплении. Кроме того выяснилось, что в клетках дрожжей P. pastoris значительная часть ИФН- находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в клетках дрожжей S. cerevisiae рекомбинантный белок накапливается в виде так называемых «телец включения» и экстрагируется только с помощью детергентов (рис.2 ).

Рис. 2. Иммуноблот внутриклеточных белков штаммов 2Р4-GRF18/pYGIB (A) и GS115/pBIG (B).

М – маркеры молекулярной массы;

1 – водорастворимые белки;

2, 3, 4 – экстракция 1%, 2,5% и 5% ДСН, соответственно.

Эти данные, свидетельствующие о том, что форма нахождения гетерологичного белка и степень его влияния на жизнедеятельность организма-продуцента зависят от вида используемых дрожжей, стали основанием для изучения влияния экспрессии гетерологичного гена на клетки дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris. Подобные исследования проводили для бактериальных клеток и обнаружили, что синтез гетерологичных белков вызывает в клетках бактерий E. coli изменения, подобные оксидативному стрессу (Remaut et al., 1986). Однако, до настоящего времени отсутствовали данные о том, как изменяется физиологическое состояние дрожжей – продуцентов чужеродных белков.

3. Исследование адаптивной способности дрожжей S. cerevisiae и P.

pastoris к стрессорным воздействиям.

Одним из показателей оксидативного стресса является увеличение числа карбонилированных белков. Измерение содержания карбонильных групп в белках штаммов-продуцентов обоих видов дрожжей продемонстрировало их увеличение относительно исходных штаммов, выращенных в тех же условиях, приблизительно в 1,5 раза (рис.3).

0,D366/D 0,0,0,0,0,0,0,0, 4P-GRF18 4P-GRF18/pYGIB GS115 GS115/pBIG Рис. 3. Содержание карбонильных групп в клеточных белках исходных штаммов и штаммов-продуцентов.

(Относительное содержание карбонильных групп определяли как соотношение поглощения при длине волны 366 нм к поглощению при длине волны 280 нм).

Полученные данные свидетельствуют о том, что продукция ИФН- является стрессорным фактором для обоих видов дрожжей и вызывает изменения, подобные оксидативному стрессу. Однако у P. pastoris не наблюдается негативного влияния рекомбинантного белка и не происходит подавления роста дрожжей-продуцентов.

Таким образом, дрожжи P. pastoris являются более устойчивыми к продукции гетерологичных белков, чем S. cerevisiae. Возможным объяснением этого явления может служить то, что метилотрофные дрожжи являются аэробными организмами, а дрожжи-сахаромицеты относятся к факультативным анаэробам, что обусловливает определенные особенности метаболизма, в частности, утилизация источников углерода у дрожжей P.

pastoris происходит за счет аэробного окисления, а у дрожжей S. cerevisiae, в основном, за счет брожения. Известно, что в клетках аэробных организмов в качестве побочных продуктов дыхания образуются активные формы кислорода (АФК), которые могут вызывать повреждения нуклеиновых кислот, белков, липидов и снижать жизнеспособность клеток (Cadenas, 1989).

Штаммы-продуценты дрожжей P. pastoris растут на несбраживаемых источниках углерода, поэтому в течение всего периода культивирования у них активно функционируют митохондрии, вырабатываются АФК и увеличивается количество шаперонов и других белков, обеспечивающих защиту клеток от оксидативного стресса. В связи с этим, к началу синтеза гетерологичного белка в клетке дрожжей P. pastoris уже будет содержаться достаточно большое количество шаперонов, и, следовательно, они изначально оказываются более устойчивыми к стрессовым воздействиям, с которыми сталкивается клетка в процессе продукции чужеродного белка. Об этом свидетельствуют и наши данные о том, что уровень карбонилирования белков у исходного штамма P. pastoris превышает таковой у S. cerevisiae.

В работах по изучению влияния оксидативного стресса на клетки дрожжей было показано, что воздействие стрессорного фактора в небольшой дозе приводит к тому, что в дальнейшем клетка становится более устойчивой как к тому же виду стресса, так и к воздействиям других негативных факторов (Estruch, 2000). Если рассматривать продукцию рекомбинантных белков у штаммов-продуцентов рекомбинантного ИФН- как процесс, являющийся стрессом для клетки хозяина, можно было ожидать, что будет наблюдаться устойчивость к другим видам стрессорных факторов.

Действительно, клетки дрожжей-продуцентов рекомбинантного ИФН- быка демонстрировали большую устойчивость к перекиси водорода, чем клетки исходных штаммов (рис. 4, 5). При этом рост дрожжей S. cerevisiae прекращался при меньших концентрациях Н2О2, чем рост дрожжей P.

pastoris, то есть дрожжи-сахаромицеты оказались менее приспособленными к воздействию оксидативного стресса, что, очевидно, объясняется особенностями метаболизма обоих видов дрожжей (Градобоева, Падкина, 2008).

1 2 А.

В.

Рис. 4. Зависимость роста штаммов дрожжей S. cerevisiae 2P4-GRF18/pYGIB (A) и 2P4-GRF18 (B) от концентрации H2O2.

1 – 0,5 мМ Н2О2 – 1 мМ Н2О3 – 1,5 мМ Н2О1 2 А.

В.

Рис. 5. Зависимость роста штаммов дрожжей P. pastoris GS115/pBIG (A) и GS115 (B) от концентрации H2O2.

1 – 1 мМ Н2О2 – 1,5 мМ Н2О3 – 3 мМ Н2О Полученные результаты позволяют сделать вывод, что, помимо уже известных преимуществ использования дрожжей P. pastoris для экспрессии гетерологичных генов, мы наблюдаем более выраженную адаптацию самих клеток этого вида дрожжей к различным видам стрессорных факторов, в том числе к продукции гетерологичных белков, что обусловлено особенностями метаболизма данного вида дрожжей. Этим, вероятно, и объясняется тот факт, что накапливаемый в клетках дрожжей P. pastoris гетерологичный белок в основном находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как дрожжи S.

cerevisiae аккумулируют чужеродный белок в виде «телец включения».

4. Получение модифицированного ИФН- быка Полученные нами штаммы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris – продуценты ИФН- быка можно использовать как кормовую иммунопробиотическую добавку. Однако, широкий спектр действия интерферонов, возможность лечения и профилактики различных заболеваний делает необходимым получение очищенного препарата ИФН- быка.

Выделение рекомбинантного белка из клеток дрожжей P. pastoris является трудоемкой процедурой, поэтому для этой цели лучше использовать секреторных продуцентов.

Ранее было показано, что секретируемый ИФН- подвержен протеолитической деградации. Анализ аминокислотной последовательности ИФН- человека выявил несколько потенциальных сайтов узнавания трипсиноподобными протеазами, два из которых расположены на С-конце молекулы (Татьков и др., 1995). Известно, что замена аминокислот в этой области приводит к потере биологической активности белка, тогда как удаление 10 аминокислот с С-конца молекулы ИФН- человека не влияет на биологическую активность белка, а напротив, ведет к повышению его стабильности, поскольку повышает устойчивость к действию протеаз (Мирошников и др., 2005).

Исходя из известной гомологии ИФН- млекопитающих (http://au.expasy.org/sprot/), предположили, что подобная модификация может стабилизировать ИФН- быка. Мы получили ген bIFNG30 с делецией тридцати пар оснований на 3’-конце, который кодирует модифицированный ИФН-(10), лишенный 10 аминокислот в С-концевой части молекулы, и сравнили устойчивость секретированного модифицированного и нативного ИФН- к протеолизу. Результаты показали, что ИФН-(10) действительно обладает повышенной стабильностью, как и в случае ИФН- человека, и при этом сохраняет биологическую активность. Секретируемый модифицированный ИФН- быка присутствует в культуральной среде даже через 72 часа, тогда как нативный белок за это практически полностью разрушается (рис. 6). Протеолитическая стабильность модифицированного ИФН-, очевидно, повышает выход рекомбинантного белка по сравнению с нативным. Это позволяет в дальнейшем использовать штамм GS115(pPIC9/BIGd10) для получения очищенного препарата ИФН- быка.

Рис. 6. Электрофореграмма и денситограмма белков культуральной среды штаммов GS115(pPIC9(IFN-)) (A) и GS115(pBIGd10) (B).

М – маркеры молекулярной массы 1, 2, 3 – спектры белков культуральной среды после 24, 48 и 72 часов индукции, соответственно 5. Изучение возможности функционирования сигнальной последовательности млекопитающих в клетках дрожжей В связи с активным использованием дрожжей для производства рекомбинантных белков, представляют бесспорный интерес процессы, происходящие с чужеродными белками в клетке-продуценте. Известно, что ИФН- человека, кроме опосредованного действия через систему вторичных мессенджеров, способен также сам попадать в ядро клетки млекопитающих за счет двух сигналов ядерной локализации (NLS): основного, локализованного в С-концевой части молекулы, и минорного, расположенного в центральной части белка (Subramaniam et al., 1998).

Исходя из известной консервативности структуры ИФН- и высокой степени гомологии ИФН- человека и ИФН- быка (http://au.expasy.org/sprot/), мы предположили наличие подобных NLS в молекуле ИФН- быка.

Для того, чтобы проверить это предположение, а также выяснить, будет ли сигнал ядерной локализации млекопитающих выполнять свою функцию в клетках дрожжей, создали плазмиды pBIG/GFP и pBIGd10/GFP, в которых экспрессия генов bIFNG и bIFNG30 происходит совместно с экспрессией гена GFP.

Штаммы дрожжей, трансформированные плазмидами pBIG/GFP и pBIGd10/GFP, культивировали в условиях индукции синтеза рекомбинантного ИФН- и определяли его локализацию в клетках дрожжей.

Результаты, приведенные на рис. 7, свидетельствовали о том, что нативный ИФН- быка в дрожжевой клетке преимущественно находится в ядре, тогда как модифицированный ИФН- быка, лишенный 10 аминокислот в С-конце, которые, как предполагалось, содержат сигнал ядерной локализации, равномерно распределен в цитоплазме.

1 а в б г Рис.7. Локализация нативного (G115/pBIG-GFP) и модифицированного (GS115/pBIGd10-GFP) интерферона-гамма быка в клетках дрожжей Pichia pastoris линия 1 – поляризационно-контрастная микроскопия (а – G115/pBIG-GFP; б – GS115/pBIGd10-GFP) линия 2 – режим эпифлюорисценции (в – G115/pBIG-GFP; г – GS115/pBIGd10-GFP) (стрелками указаны окрашенные ядра) Таким образом, полученные данные подтвердили гипотезу о том, что в молекуле ИФН- быка также имеется сигнал ядерной локализации, расположенный в С-концевой части молекулы. Кроме того, сигнал ядерной локализации высших эукариот выполняет свою функцию в клетках низших, что свидетельствует о консервативности процесса транслокации белков. Эти сведения необходимо учитывать в работах по гетерологичной экспрессии, так как попадание чужеродного белка в ядро или другой компартмент клетки-продуцента может оказывать негативное влияние, поскольку существует вероятность его участия в различных метаболических процессах клетки хозяина.

Таким образом, в результате данной работы, нами были получены штаммы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris, осуществляющие синтез рекомбинантного ИФН- быка и аккумуляцию его внутри клетки. Данные штаммы могут быть использованы в качестве кормовой добавки для крупного рогатого скота.

Определение продуктивности двух полученных штаммов показало, что уровень синтеза рекомбинантного белка составляет около 10 мг/л у штамма дрожжей S. cerevisiae 2Р4-GRF18/pYGIB и 15-20мг/л у штамма дрожжей P.

pastoris GS115/pBIG.

Сравнивая кривые роста исходных штаммов и штаммов-продуцентов, мы выяснили, что синтез чужеродного белка является метаболической нагрузкой для клеток дрожжей S.cerevisiae, что выражается, в первую очередь в замедлении роста культуры. В случае P.pastoris подавления роста не происходит. В то же время, синтез чужеродного белка является для клеток дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris стрессорным фактором, о чем свидетельствует повышение уровня карбонилированных белков у штаммовпродуцентов. При этом дрожжи P. pastoris оказались более устойчивыми к стрессовым воздействиям, что, вероятно, обусловлено особенностями метаболизма этого вида дрожжей. Возможно, поэтому в клетках дрожжей P.

pastoris синтезированный белок, в основном, находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае S. cerevisiae он образует «тельца включения» и экстрагируется из разрушенных клеток только в присутствии детергента.

Мы показали, что удаление 10 С-концевых аминокислот в ИФН- быка, как и в ИФН- человека, сопровождается повышением устойчивости к протеолитической деградации. При этом внесенные изменения не приводят к потере биологической активности.

Мы продемонстрировали возможность функционирования сигнала ядерной локализации млекопитающих в клетках дрожжей и установили, что он определяет локализацию рекомбинантного белка.

ВЫВОДЫ.

1. Синтез рекомбинантного ИФН- быка и накопление его в клетках подавляет рост штамма дрожжей S. cerevisiae (2Р4-1GRF18/pYGIB). У дрожжей P. pastoris ВКПМ Y-(GS115/pBIG) подавления роста не происходит, несмотря на более высокий уровень продукции.

2. В клетках дрожжей P. pastoris гетерологичный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае S. cerevisiae он образует «тельца включения» и экстрагируется из клеток только в присутствии детергента.

3. Продукция гетерологичного ИФН- сопровождается повышением уровня карбонилированных белков является стрессорным фактором у обоих видов дрожжей.

4. Штаммы-продуценты обоих видов дрожжей более устойчивы к оксидативному стрессу, чем исходные штаммы. При этом дрожжи P. pastoris оказались более адаптированными к стрессорным воздействиям, в том числе к синтезу гетерологичного белка, что обусловлено особенностями метаболизма.

5. Получен модифицированный ИФН- быка, лишенный десяти С-концевых аминокислот, содержащих участок расщепления трипсиноподобными протеазами. Показано, что модифицированный белок, секретируемый штаммом дрожжей P. pastoris GS115(pPIC9/BIGd10), не подвергается протеолизу в течение 72 часов культивирования и сохраняет биологическую активность.

6. Установлено наличие сигнала ядерной локализации в молекуле ИФН- быка. Показано, что сигнал ядерной локализации млекопитающих выполняет свою функцию в клетках дрожжей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Градобоева А.Е., Падкина М.В., Парфенова Л.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS105(pBIG) – продуцент внутриклеточного иммунного интерферона быка, рекомбинантная плазмидная ДНК pBIG, обеспечивающая биосинтез внутриклеточного иммунного интерферона быка и способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pBIG. Патент РФ №2231545 С1, 2002.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»