WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Выбор преждевременно конденсированных хромосом (ПКХ) в качестве объекта диктуется тем, что в ПКХ, сформировавшихся в ядрах на стадии Sфазы, реплицирующийся хроматин кластеризован и пространственно отделён от хроматина, не вступившего в репликацию или закончившего этот процесс.

На хромосомных препаратах таких клеток хроматин клетки-реципиента представляет собой скопление мелких фазово-плотных, DAPI-позитивных блоков, связи между которыми на уровне разрешения светлопольной и флуоресцентной микроскопии не выявляются – т.н. «пульверизованный хроматин». На препаратах клеток, фиксированных in situ и окрашенных ДНКспецифичными флуорохромами, такой хроматин представлен мелкозернистой окрашенной массой, отдельными элементами которой являются отрезки фибрилл или цепочек, состоящих из последовательно расположенных глобул.

На хромосомных препаратах, приготовленных с использованием гипотонической обработки и фиксации смесью спирта и уксусной кислоты, репликационная метка, включающаяся в «пульверизованный» хроматин, выявляется преимущественно рядом или между плотными блоками. При этом колокализации обогащенного ДНК материала и зон, в которых выявляется бром-содержащая новореплицированная ДНК, не наблюдается. Сайты включения представлены отдельными точечными образованиями, индивидуальными или собранными в цепочки из нескольких флуоресцентных единиц. В цепочках отдельные фокусы разделены промежутками, в которых не выявляется ни DAPI-позитивный, ни БрдУ-содержащий материал.

На препаратах, зафиксированных in situ, или на хромосомных препаратах, приготовленных без использования кислой фиксации, достаточно сложно точно определить пространственные отношения между сайтами репликации и тотальным хроматином. Однако, в массе своей, БрдУ-содержащие сайты обособлены от DAPI-позитивного материала.

В клетках с ПКХ, способных к включению репликационной метки, могут выявляться и фибриллярные комплексы тотального, немеченого хроматина. В этом случае визуально хроматиновые фибриллы напоминают ПКХ, индуцированные в G2. В них наблюдаются участки, где прослеживаются две хроматиды, однако общая толщина таких хромосом, в отличие от настоящих G2-ПКХ или митотических хромосом, не постоянна. В таких клетках новореплицированная ДНК выявляется на периферии фибрилл хроматина в виде очень крупных блоков, в которых отдельные точечные сайты неразличимы.

Для изучения хроматина, закончившего репликацию, предшественник вносили за 15 минут до индукции слияния клеток и выявляли через 45 минут после слияния.

На хромосомных препаратах из таких клеток отчетливо видны линейные ассоциации меченых единиц. Они также имеют вид цепочек, однако в них расстояния между отдельными флуоресцентными единицами существенно меньше, чем на препаратах из клеток, получивших импульсную метку.

При удлинении периода ожидания до 180 минут (135 минут до индукции слияния клеток и 45 минут после), БрдУ-содержащий материал колокализуется с конденсированными элементами пульверизованного хроматина.

В некоторых клетках, за время ожидания перешедших в фазу G2, сформировались хромосомы, демонстрирующие характерное распределение метки в виде поперечных полос, аналогичных выявляемым на митотических хромосомах методом репликационного бэндинга.

Клетки с ПКХ предоставляют уникальную возможность наблюдать естественное фракционирование хроматина по его способности к компактизации, что делает эту модель своеобразным in vivo эквивалентом пермеабилизации в растворах с низкой ионной силой. Обе модели наглядно демонстрируют зависимость способности хроматина к упаковке в структуры высшего порядка от его репликационного статуса.

Использование репликационного мечения в сочетании с иммуноцитохимической визуализацией сайтов включения позволило продемонстрировать наличие нескольких зон включения предшественников ДНК в растянутых деконденсированных сегментах, соединяющих отдельные конденсированные блоки в составе пульверизованного хроматина в клетках с ПКХ. Этот факт является прямой демонстрацией кластеров репликационных единиц в живых клетках.

Также была показана прогрессия упаковки материала отдельных репликонов в фибриллы хроматина. Согласно полученным данным, при завершении репликации данного сегмента ДНК, упаковка реплицированной ДНК в фибриллу хроматина – предположительно, уровня хромонемы. Однако такая хромонема не способна к дальнейшей упаковке в более крупные блоки.

Данные литературы позволяют с уверенностью считать выявляемые в составе пульверизованного хроматина конденсированные блоки сегментами формирующихся хроматид, на что указывает, в первую очередь, динамика изменения их размеров, количества и взаиморасположения, охарактеризованная в работе (Mullinger and Johnson, 1983). Новореплицированный хроматин приобретает способность упаковываться в надхромонемные структуры по прошествии нескольких часов после завершения репликации.

В пользу этого утверждения свидетельствуют не только результаты изучения локализации отложенной метки, но и прямая визуализация клеток, в которых продолжается репликация отдельных сегментов ДНК на фоне хромосом, повторяющих строение G2-ПКХ и демонстрирующих четко выраженные две хроматиды. Это наблюдение показывает, что к концу S-фазы большая часть хроматина, завершившего репликацию, полностью готова к дальнейшей компактизации.

Данные, полученные при изучении клеток с ПКХ, согласуются с результатами визуализации отложенной метки на ультраструктурном уровне. В части клеток выявляются достаточно протяженные меченые участки хромонемных элементов, в которых реплицированный хроматин выявляется в хорошо различимых отдельных сегментах, отождествляемых с хромомерами.

Эти данные позволяют предполагать, что именно хромомеры являются формой упаковки индивидуальных репликонов.

Важно отметить, что при электронно-микроскопическом исследовании с применением пермеабилизации в растворах с низкой ионной силой, в большинстве клеток после отложенного мечения нельзя выявить точек бифуркации и участков, на которых прослеживались бы две параллельные меченые фибриллы хроматина, в то время, как данные, полученные с помощью флуоресцентной гибридизации in situ, показывают, что сегрегация новореплицированной ДНК происходит почти сразу после завершения репликации (Selig et al., 1992).

Модель организации репликационного сайта и структурной организации реплицируемого хроматина.

В свете представленных данных предлагается следующая универсальная модель организации репликационного процесса в контексте высших уровней организации хроматина (рис. 2). Единица репликации – линейный репликон (сегмент молекулы ДНК, реплицируемый одним репликационным комплексом) - соответствует хромомеру, глобулярному хроматиновому комплексу диаметром 60-100 нм. Линейные ассоциации хромомеров формируют сегменты хромонем. В активно транскрибирующемся хроматине хромонемы могут не выявляться, распадаясь на отдельные хромомеры, что косвенно подтверждается данными литературы (Muller et al.., 2001; Muller et al.., 2004).

Индивидуальные хромомер представляет собой плотную ассоциацию нуклеомеров – относительно независимых друг от друга сегментов элементарной хроматиновой фибриллы диаметром 30 нм (Кирьянов и др.., 1981). Инициация репликации приводит к дестабилизации хромомеров.

Хроматин разворачивается до 30-нм нуклеомерной фибриллы и в такой форме реплицируется. Нельзя отрицать возможность существования хроматина в форме 10-нм нуклеосомной фибриллы в непосредственной близости или внутри репликационного комплекса (реплисомы).

Рис. 2. Модель организации РС. а – Тандемно расположенные, одновременно начинающие функционировать репликоны в составе фибрилл хроматина. Исходный хроматин обозначен серым цветом, прошедший репликацию – темно-серым. Реплисомы обозначены белыми ромбами. Пунктирный контур – границы флуоресцентного РС. б-е – Этапы корепликационных преобразований индивидуального хромомера, глобулярного комплекса диаметром 100 нм, содержащего 7-10 нуклеомеров или 70-100 нуклеосом.

Инициация репликации вызывает распад хромомера на нуклеомеры. Восстановление хромомерной конформации происходит после прохождения репликационного комплекса.

Завершение репликации соседних репликонов происходит при встрече движущихся навстречу друг другу реплисом.

Зона репликации ДНК (репликационный сайт) представляет собой участок локальной деконденсации хромонемы. Тот факт, что деконденсация одного сегмента хромонемы может не затрагивать соседние хромомеры, позволяет определять репликционный сайт как субхромосомный микродомен, относительно независимый от соседних сегментов. Имеющиеся данные о поведении меченых участков ДНК в последующих клеточных циклах (Sparvolli et al., 1994; Jackson and Pombo, 1998) дают все основания предполагать подобное поведение и для хромомеров, формирующихся после завершения репликации в данной зоне.

Современные модели топологических преобразований ДНК указывают на ключевую роль разделения молекулы ДНК на топологические домены, без чего не возможна эффективная декатенация и сегрегация дочерних цепей ДНК после завершения репликации (Hardy et al., 2004). Можно предполагать, что хромомерная организация ДНК является отражением системы барьеров, выполняющих эту функцию.

Упаковка новореплицированного хроматина в комплексы высшего порядка осуществляется в течение нескольких минут после прохождения полимеразы.

Происходит частичное восстановление хромомерной конформации. Сегрегация новореплицированного материала происходит спустя некоторое время после завершения репликации данного сегмента молекулы ДНК.

В эухроматических доменах единовременная активация происходит в немногочисленных тандемно расположенных репликонах, а при репликации гетерохроматиновых областей синхронно инициируется большое количество репликационных единиц. Имеющиеся данные пока не позволяют дать ответ на вопрос о природе механизма синхронной активации репликации в нескольких репликонах.

Репликационный сайт, визуализируемый иммуноцитохимическими методами с помощью светового микроскопа, представляет собой несколько пар репликационных комплексов, движущихся вдоль 30 нм фибрилл хроматина.

Подвижность полимераз ограничена в небольшом объеме из-за взаимодействия с более компактным хроматином, окружающим репликационный сайт, и поэтому не может быть выявлена при светооптических наблюдениях.

Выводы.

1) Показано, что оптимальным подходом к визуализации РС, обеспечивающим сохранность структур хроматина, является выявление репликационной метки на поверхности ультратонких срезов.

2) В условиях структурной модификации хроматина, общая организация паттернов распределения РС, соответствующих различным стадиям S-фазы, не претерпевает изменений. При полной экстракции гистонов сохраняется только паттерн, соответствующий ранней S-фазе.

3) При декомпактизации хроматина до нуклеосомных фибрилл РС сохраняют дискретность, но частично декомпактизируются. Полная декомпактизация РС происходит только при исчерпывающей экстракции гистонов в условиях отложенного мечения.

4) Реплицируемый хроматин, включающий импульсную метку, формирует линкеры между компактными сегментами хромонем, представлен фибриллами и глобулярными элементами диаметром 30-40 нм и не компетентен к компактизации в макромолекулярные комплексы более высокого порядка – хромомеры и хромонемы.

5) В условиях, позволяющих выявлять иерархические уровни компактизации хроматина (нуклеомеры и хромомеры/хромонемы) не обнаружено структур, соответствующих гипотетическим «репликационным фабрикам».

6) Структурная организация реплицирующегося хроматина не различается в эухроматине, факультативном и конститутивном гетерохроматине.

7) Основным структурным мотивом конститутивного гетерохроматина является плотно уложенная хромонема, состоящая из хромомеров.

8) Эу– и гетерохроматические домены отличаются друг от друга по размерам кластеров репликонов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Лазарева Е.М., Наджип Г. А., Голышев С. А., Поляков В. Ю., Динамика репликационных сайтов и макромолекулярных комплексов хроматина (хромонем) в клетках Allium cepa L. Биологические мембраны, 22(3):

188-195 (2005).

Голышев С.А., Шеваль Е.В., Вихрева П.Н., Поляков В.Ю. Гетерогенность структуры и состава хромоцентров в клетках линии L929. Материалы XV Всероссийского совещания «Структура и функции клеточного ядра», Цитология, 47(9): 804 (2005).

Поляков В.Ю., Зацепина О.В., Киреев И.И., Прусов А.Н., Файс Д., Шеваль Е.В., Коблякова В.Ю., Голышев С.А., Ченцов Ю.С., Структурнофункциональная модель митотической хромосомы. Биохимия, 71(1): 6-(2006).

Голышев С.А., Поляков В.Ю. Ультраструктура хроматина в сайтах репликации.

В печати.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»