WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Недостатком такого метода является то, что частицы коллоидного золота располагаются только на поверхности среза, что ограничивает возможность изучения образца только классическими методами электронной микроскопии, не позволяя в полной мере применить возможности современной электронномикроскопической томографии (Marco et al., 2004; MacIntosh et al., 2005).

Таким образом, сочетание обработки клеток растворами, стабилизирующими макромолекулярные комплексы хроматина, с выявлением репликационной метки на ультратонких срезах открывает широкие перспективы для изучения топологии сайтов репликации и организации хроматина.

Ультраструктурная организация реплицирующегося хроматина в клетках линии L929.

Эухроматин и факультативный гетерохроматин. В клетках линии L929, пермеабилизированных в присутствие ионов кальция (2 ммоль ТРИС, ммоль CaCl2), хроматин структурируется. Большая часть хроматина представлена глобулярными образованиями диаметром 60-80 нм – «элементарными» хромомерами, тесно ассоциированными в протяженные фибриллы – хромонемы.

Новореплицированная ДНК преимущественно выявляется в зонах частичной деконденсации ДНП-материала, и гораздо реже выявляются компактных хромомерах.

В областях деконденсации выявляются частицы диаметром ~30 нм – нуклеомеры – которые формируют аморфные кластеры или линейные ассоциации, выявляющиеся между сегментами хромонем. Также выявляются аморфные образования с пониженной, по сравнению с материалом хромомеров, электронной плотностью.

Особый интерес представляют структуры, интерпретированные нами как участки бифуркации фибрилл хроматина (рис. 1а, б). Это отчетливо выявляемые структуры длиной до 0,2 мкм, состоящие из трех цепочек глобул диаметром 30 нм, расходящихся из одной точки. Репликационная метка выявляется как в точке бифуркации, так и вне ее, на расходящихся фибриллах.

В случае, когда структура, содержащая зону бифуркации, лежит в плоскости среза, видно, что тонкие фибриллы диаметром 30 нм в ее составе оканчиваются в контакте с ближайшими хромомерами, однако малая толщина срезов не позволяет прослеживать ход большей части фибриллярных элементов.

Перевод пермеабилизированных клеток в раствор, содержащий 0,1 ммоль ионов кальция, приводит к тому, что хромомеры превращаются в агрегаты глобул диаметром 30 нм. При этом нивелируются структурные отличия реплицирующегося и тотального хроматина.

Полученные результаты указывают на то, что основной формой организации ядерного материала являются глобулярные образования диаметром 60-80 нм и линейные ассоциации таких элементов. Единичные глобулярные структуры соответствуют «элементарным» хромомерам, а их линейные ассоциации – сегментам хромонем (Зацепина и др., 1983).

Зоны высокой концентрации ДНП-материала, такие, как периферический гетерохроматин, с которым мы соотносим фибриллярные комплексы, выявляемые светооптическими методами, характеризуются большим количеством витков или петель хромонемы в единице объема, что может быть обусловлено формированием многочисленных контактов этих сегментов хромосомы с ядерной оболочкой.

На текущий момент не накоплен достаточный объем данных, позволяющих связать топологию фибриллярных комплексов хроматина с биохимическими процессами, осуществляемыми на них. Имеющиеся факты Рис. 1. Сайты репликации в пермеабилизированных клетках линии L929: а, б – в эухроматических областях; в – в конститутивном гетерохроматине.

Стрелками отмечены фибриллы диаметром 30 нм.

консолидируются в два блока. Первые получены биохимическими методами и не позволяют делать какие-либо выводы о структурных уровнях выше фибриллы диаметром 30 нм (Gilbert et al., 2004). Вторые получены методами световой микроскопии, которые позволяют анализировать динамику хроматиновых комплексов высшего порядка (Volpi et al., 2000; Muller et al., 2001), тонкие детали строения которых остаются не изученными. Важно отметить, что все эти данные получены при изучении преобразований, связанных с активацией и прогрессией транскрипции. Тем не менее, в настоящее время признается, что процессы, в которые вовлекается хроматин, требуют его перехода в более «открытое», менее компактное состояние (Volpi et al., 2000; Mahy et al., 2002).

Модель, предложенная в работе (Jaunin et al.., 2000), предусматривает периферическую локализацию активно реплицируемой ДНК по отношению к комплексам конденсированного хроматина, которая сохраняется в течение приблизительно пяти минут, после чего начинается миграция новореплицированного материала в зоны, занятые конденсированным хроматином.

Режим импульсного внесения предшественника, использованный в настоящей работе, позволяет выявлять только хроматин уже покинувший репликационный комплекс, локализующийся в интерхроматиновом пространстве. Результаты визуализации репликационной метки в клетках, не подвергнутых пермеабилизации, полностью согласуются с такой моделью.

Однако, данные, полученные при изучении клеток, пермеабилизированных в растворах с низкой ионной силой, свидетельствуют, что меченый хроматин выявляется в составе менее конденсированного материала, часто представленного 30 нм глобулами, что говорит о том, что, несмотря на завершение репликации, новосинтезированные ДНП-комплексы еще не приобрели свойства тотального хроматина.

Совокупность результатов позволяет сделать вывод о том, что, несмотря на конденсацию новореплицированной ДНК, выявляемую в клетках, фиксированных in situ, хроматин в репликации оных сайтах реагирует на изменения ионного состава иначе, чем хроматин тотальный, не формируя хромомеров.

Важно отметить, что ни в клетках, фиксированных in situ, ни в клетках, подвергнутых пермеабилизации в растворах с низкой ионной силой, не удается выявить структур, по плотности, размерам и строению отличающихся от элементов хроматина, и в то же время обогащенных меткой, соответствующей новореплицированной ДНК. Таким образом, полученные в настоящей работе данные находятся в противоречии с моделями, постулирующими существование субъядерных «репликационных органелл» или «репликационных фабрик» (Hozak et al., 1993; Cook, 2000).

Обнаруженные в некоторых клетках бифуркации ДНП-фибрилл диаметром 30 нм, в которых меченый материал выявляется непосредственно в зоне ветвления или вблизи этого участка, предельно соответствуют представлению о репликации ДНК в контексте подвижных репликационных комплексов, скользящих вдоль фибрилл хроматина. Такое представление в настоящее время непопулярно, и большее предпочтение отдается модели о неподвижных полимеразах, протягивающих нити ДНК сквозь себя (DNA spooling model) (Cook, 1999).

Наблюдение многочисленных зон бифуркации хроматиновых фибрилл могло бы стать важным аргументом в пользу гипотезы о «свободных» репликационных комплексах, но отчетливые зоны бифуркации встречаются достаточно редко.

В то же время нельзя исключать возможность частичной экстракции компонентов реплисом в условиях, использованных в настоящей работе, так как при приготовлении препаратов не применяли реагентов, присутствие которых приводит к стабилизации белкового наполнения ядра и формированию структур ядерного матрикса (Lebkowski and Laemmli, 1982).

Конститутивный гетерохроматин. Во время репликации сателлитной ДНК хромоцентры теряют четкие очертания и правильную эллипсоидную форму, на их периферии становятся различимы многочисленные впячивания и выступы. Меняется характер окрашивания материала хромоцентра флуорохромом DAPI – окраска становится негомогенной, начинают выявляться мелкие детали.

При этом меченый материал располагается как в периферической области хромоцентров, так и, в случае крупных хромоцентров, на фоне тотального материала. В мелких хромоцентрах меченый материал располагается на периферии блока. Сигнал, соответствующий новореплицированной ДНК, выявляется в зонах, обедненных тотальной ДНК хромоцентров.

В остальные периоды S-фазы хромоцентры сохраняют гладкие контуры и окрашиваются АТ-спефичными ДНК-связывающими флуорохромами однородно.

Одной из проблем, затрудняющих изучение ультраструктуры хроматина, является отсутствие хорошо различимых маркерных структур, позволяющих выявлять и отслеживать конкретные локусы хромосом без применения вспомогательных процедур. Большой прогресс в этой области был достигнут с внедрением в исследовательскую практику трансгенной системы на основе HSR (Homgeneously Staining Region, тандемного повтора гена дигидрофолатредуктазы, возникающего в клетках некоторых линий под действием метатрексата (Robinett et al., 1996)), позволяющего методами флуоресцентной микроскопии изучать динамику этого локуса во времени (Li et al., 1998).

Хромоцентры, выявляемые в ядрах клеток некоторых грызунов, являются не менее удобным маркером. Ключевая особенность этой модельной системы состоит в том, что хромоцентры представляют собой естественные, генетически однородные домены хроматина (Guenatri et al., 2004; Kuznetsova et al., 2005).

Кроме того, хромоцентры находятся в компактном состоянии на всем протяжении клеточного цикла (Прокофьева-Бельговская, 1984).

В ядрах клеток, пермеабилизированных в присутствие ионов кальция, толщина фибрилл хроматина в хромоцентрах такая же, как и в тотальном хроматине, но они упакованы гораздо плотнее и однороднее по толщине. В небольших лакунах между фибриллами выявляется аморфный материал с меньшей, чем у хроматина, электронной плотностью.

Реплицирующиеся хромоцентры менее конденсированы. Расстояния между соседними петлями хромонемы в них увеличено. Весь блок становится достаточно аморфным, в то время как нереплицирующийся хромоцентр на срезе чаще всего имеет форму, близкую к округлой.

Помимо общей деконденсации на уровне хромонем, в реплицирующихся хромоцентрах выявляются зоны диссоциации хромонемных элементов, в которых хроматин представлен глобулами со средним диаметром 30±5,4 нм, аналогичными обнаруженным в зонах бифуркации фибрилл ДНП. Гранулы коллоидного золота в таких препаратах маркируют периферические области или поверхности хромонемных элементов, где материал наиболее деконденсирован и имеет меньшую электронную плотность (рис. 1б).

Изучение серийных срезов показало, что репликация идет не только по периферии хромоцентра, как можно заключить на основе анализа данных оптической микроскопии, но и во внутренних областях.

Реплицируемый периферический гетерохроматин также переходит в деконденсированное состояние. В полном соответствии с данными оптической микроскопии, сайты репликации в этом ядерном домене имеют большие размеры, сложную структуру и прилегают к ядерной оболочке. Подавляющая масса золотых частиц, маркирующих новореплицированную ДНК, так же, как и в других ядерных доменах, приурочена к наиболее деконденсированным зонам и разрывам между отдельными глобулярными элементами различного диаметра.

При дифференциальной деконденсации нереплицирующиеся хромоцентры в значительной степени разрыхляются – увеличиваются размеры лакун между фибриллами, но фибриллярная организация не претерпевает значительных изменений. Диаметр фибрилл в составе хромоцентра составляет те же 60-80 нм.

В реплицирующихся хромоцентрах в этих ионных условиях происходит полная деконденсация хромонемных элементов до 30 нм фибрилл.

Генетическая однородность материала хромоцентров позволяет предполагать и однородность их ультраструктурной организации. Данное предположение удалось подтвердить прямым наблюдением. Полученные данные находятся в частичном противоречии с опубликованными в работе (Фролова и др., 1989), где постулируется отсутствие хромонемных элементов в прицентромерном гетерохроматине клеток мыши. Такое несоответствие может объясняться отличиями ионного состава среды, используемой для пермеабилизации. В работе (Фролова и др.., 1989) раствор, используемый для пермеабилизации кеток, содержал не только ионы кальция, но и 1 ммоль ионов магния. Нельзя исключить возможность конкуренции и/или кооперативного взаимодействия этих ионов с хроматином, а также решающее влияние высокой концентрации двухвалентных катионов, приводящей к гораздо более сильной конденсации хроматина.

В настоящей работе впервые проведен сравнительный анализ данных оптической и световой микроскопии, полученных при изучении клеток, в которых происходит репликация сателлитной ДНК. Выявляемая на уровне оптической микроскопии неоднородность материала реплицирующихся хромоцентров соответствует уже имеющимся данным о перераспределении реплицированного хроматина в составе прицентромерных блоков (Quivi et al., 2004). Предложенная авторами модель предполагает репликацию ДНК на периферии гетерохроматинового блока с последующей миграцией материала во внутренние области хромоцентра (Quivi et al., 2004).

Ультраструктурные данные показывают, что репликация сателлитной ДНК идет во всем объеме хромоцентра или на протяженных сегментах хромонемы, слагающей хромоцентр. Светооптические данные могут быть интерпретированы не с позиции направленной миграции, а в контексте конденсации-деконденсации ДНП-материала.

Репликация материала хромоцентров осуществляется в течение достаточно короткого промежутка времени (Guenatri et al., 2004). В связи с этим есть все основания предполагать, что репликация гетерохроматиновых локусов происходит за счет единовременной активации большого числа репликонов.

Известно, что компактная конформация и репрессированное состояние гетерохроматина частично определяются эпигененетически и поддерживаются специфичными для гетерохроматина белковыми ансамблями, обладающими репрессорной и компактизирующей функциями (Craig, 2005). Репликация ДНК приводит к утрате части маркеров, ассоциированных с молекулами гистонов (Smith et al., 1984; Krude and Knippers, 1991; Randall and Kelly, 1992), что приводит к разрушению микроокружения гетерохроматиновых локусов и частичной потере компактного состояния. В пользу этого предположения выступают и данные о вовлечении в процесс репликации гетерохроматина АТФ-зависимых белковых комплексов, изменяющих конформацию нуклеосом (Collins et al., 2002.

Реакция реплицирующихся хромоцентров на дифференциальную деконденсацию, предположительно, так же определяется понижением прочности связывания или временным уменьшением количества белков, детерминирующих гетерохроматиновый статус.

Упаковка хроматина, закончившего репликацию.

При использовании отложенного мечения в пермеабилизированных клетках гранулы золота выявляются над конденсированными хроматиновыми элементами. Особый интерес представляют протяженные фибриллярные ансамбли, имеющие толщину 60-80 нм. В составе таких фибрилл четко выявляются отдельные сегменты, каждый из которых несет метку.

Зоны репликации в преждевременно конденсированных хромосомах.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»