WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Общая организация ядер исследуемых клеток. В качестве моделей в работе использовались две линии культивируемых клеток – СПЭВ и L929, ядра которых различаются по характеру компактизации хроматина. В ядрах клеток СПЭВ, окрашенных DAPI, материал, содержащий ДНК, представлен флуоресцирующими зонами различного размера, в которых можно различить дискретные глобулы и тонко фибриллярные элементы. В этом типе клеток хорошо выражен слой околоядрышкового хроматина и неокрашенные интерхроматиновые зоны, однако в целом материал распределен в нуклеоплазме однородно.

В ядрах клеток линии L929 прицентромерный гетерохроматин структурно обособлен и представлен дискретными блоками (хромоцентрами), хорошо различимыми при окраске ДНК флуоресцентными красителями.

Преимущественно хромоцентры располагаются на периферии ядра и ядрышек.

Околоядрышковый гетерохроматин в клетках линии L929 выражен слабее, чем в клетках линии СПЭВ.

Динамика репликационных сайтов в клетках линии СПЭВ и Lфиксированных in situ. В импульсно меченых клетках обеих линий зоны, включающие предшественник синтеза ДНК – репликационные сайты (РС) – представляют собой флуоресцирующие точечные структуры. В клетках линии СПЭВ выявляются три хорошо различимых типа распределения РС, а в клетках линии L929 – четыре. На основании имеющихся данных литературы (O’Keefe et al., 1992; Guenatri et al., 2004) они были классифицированы и сопоставлены со стадиями протекания S-фазы.

Первый тип соответствует начальной стадии S-фазы и характеризуется равномерным распределением точечных сайтов репликации в нуклеоплазме, за исключением зоны ядрышка и периферии ядер.

Второй тип характеризуется наличием немногочисленных крупных интенсивно метящихся сайтов, имеющих сложное строение. Иногда в их составе можно выявить отдельные точечные элементы. Сайты репликации выявляются в ассоциации с ядрышком и на периферии ядра. Такой тип распределения РС соответствует среднему периоду S-фазы.

В клетках линии L929 для средней S-фазы характерны два типа распределения реплицирующейся ДНК. В обоих случаях РС объединены в крупные, имеющие сложную структуру ассоцииации, которые либо колокализуются с хромоцентрами, либо контактируют с ними без перекрывания областей DAPI- и БрдУ-позитивного окрашивания. Второй случай, предположительно, соответствует репликации блоков минорного сателлита (Guenatri et al.., 2005).

Третий тип мечения характеризуется наличием многочисленных точечных сайтов репликации, расположенных на периферии ядер и вокруг ядрышка. Этот тип мечения соответствует позднему периоду S-фазы.

При использовании отложенного мечения перераспределения меченого материала по сравнению с импульсным мечением не выявляются.

Длительное мечение. При увеличении времени инкубации клеток с 5’БрдУ до 60 минут общая картина распределения реплицированного материала так же, как и в случае отложенного мечения, не изменяется по сравнению с картиной, выявляемой при импульсном внесении БрдУ, однако повышается интенсивность мечения.

При увеличении времени мечения до трех часов в ядрах, по распределению РС соответствующих ранним и поздним периодам S-фазы, выявляются цепочки меченых сайтов и отрезки тонких фибрилл. В ядрах, получивших длительную метку в поздний период S-фазы, фибриллярные элементы имеют большую толщину и протяженность. С помощью конфокальной микроскопии показано, что фибриллярные ассоциации блоков поздно реплицирующегося меченого хроматина находятся на периферии ядер в тесном контакте с ядерной оболочкой.

В ядрах с типом мечения, соответствующим средней S-фазе, в клетках обеих линий выявляются сложно организованные компактные блоки меченого материала, ассоциированные с ядерной оболочкой и периферией ядрышек.

Такой характер длительного мечения указывает на глобулярную организацию этих доменов и более плотную упаковку ДНП.

Таким образом, длительное репликационное мечение позволяет выявлять фибриллярные мотивы организации генома на светооптическом уровне. Это дает основание предполагать, что различные субхромосомные домены не только отличаются по структуре и способу упаковки хроматина, но и по способу разделения молекулы ДНК на единицы репликации.

Эти наблюдения также согласуются с данными о том, что активация новых репликационных единиц происходит в непосредственной близости от локусов хроматина, уже завершивших свою репликацию, что приводит к направленному перемещению зоны репликации вдоль фибриллы хроматина (Manders et al., 1992; Manders et al., 1996).

РС в условиях структурной модификации хроматина. Пермеабилизация в растворах с низкой ионной силой, содержащих двухвалентные катионы (ммоль ТЭА, 4 ммоль MgCl2 или 2 ммоль TRIS, 3 ммоль CaCl2) приводит к структурированию содержимого ядер, однако характерные типы локализации реплицируемой ДНК сохраняют свои различия.

При пермеабилизации клеток в растворе, не содержащем двухвалентных катионов, происходит полная декомпактизация хроматина в ядрах. Несмотря на дисперсию содержимого ядра, взаимное расположение различных фракций хроматина и характерные типы распределения РС в пермеабилизированных клетках не нарушаются. Отдельные репликационные сайты при этом деконденсируются, увеличиваясь в размерах по сравнению с контролем.

Тот факт, что в растворах, не содержащих двухвалентных катионов, реплицированный материал сохраняет относительно компактную конформацию, когда тотальный хроматин представлен нуклеосомными фибриллами (Kiryanov et al., 1976; Kiryanov et al., 1982; Prusov et al., 1983), может быть объяснен с помощью следующего приблизительного расчета. При средней скорости репликации около тысячи пар оснований в минуту (Hozak et al., 1994), и длине сегмента молекулы ДНК, соответствующего одной нуклеотидной паре, равной 0,48 нм, за 15 минут реплицируется сегмент молекулы ДНК длиной 7,2 мкм. Такой отрезок ДНК, будучи упакованным в нуклеосомную фибриллу (степень компактизации 1:7-10, (Bak et al., 1979)), будет иметь линейные размеры порядка 0,7-1 мкм при толщине фибриллы нм. Представляется возможным, что такой отрезок фибриллы за счет взаимодействия с окружающим хроматином, может сохранять компактную конформацию и удерживаться в пределах объема диаметром 0,2-0,4 мкм, но не формировать при этом упорядоченных структур.

Полученные данные согласуются с данными о том, что нуклеосомные частицы не теряют связи с реплицируемой ДНК (Jackson, 1990; Krude and Knippers, 1991; Randall and Kelly, 1992). Таким образом, есть все основания считать, что гистоны играют важную роль в компактизации ДНК в сайтах репликации.

Роль гистонов и негистоновых белков в организации РС. При обработке клеток двумолярным раствором хлорида натрия в присутствие ионов меди формируется нуклеоид, состоящий из остаточного ядра (ядерного матрикса) и окружающего его ДНК-содержащего гало. Данные электронной микроскопии свидетельствуют, что материал гало представлен тонкими фибриллами, соответсвующими депротеинезированным молекулам ДНК.

В части клеток реплицируемая ДНК локализуется во внутренней области нуклеоида. При этом сохраняется сходство пэттерна окрашивания нуклеоида с распределением ранореплицирующейся ДНК в неэкстрагированных клетках.

Реплицирующийся материал, расположенный преимущественно на периферии ядер, выявляется не только на границах нуклеоидов, но и снаружи – в зоне гало. Протяженность меченых отрезков ДНК, покидающих границы остаточного ядра, незначительна по сравнению с общими размерами гало.

При отложенном мечении так же выявляется фракция ДНК, сохраняющая свою локализацию внутри остаточного ядра и сходство с пэттерном ранней Sфазы. Такие ядра окружены небольшим слабо-флуоресцирующим гало, что указывает на уменьшение сродства ДНК эухроматина к «ядерному матриксу» после завершения репликации.

Этот факт может быть объяснен тем, что скорость репликации в ранней Sфазе невысока, а размер индивидуальных репликонов и количество репликонов в кластерах в эухроматических областях меньше. В пользу этой гипотезы выступают полученные в настоящей работе данные о том, что, при длительной инкубации клеток в присутствие 5’-БрдУ, в клетках, демонстрирующих репликацию эухроматина, выявляются короткие и тонкие фибриллярные комплексы, в то время, как при той же продолжительности мечения в гетерохроматических областях выявляются гораздо более протяженные фибриллы большего диаметра.

Кроме того, РНК-полимеразы при проведении процедур экстракции также становятся компонентами ядерного матрикса (Vincent et al., 1996; Wei et al., 1999), и могут вносить свой вклад в удержание ранореплицируемой ДНК эухроматина внутри остаточного ядра. Стойкая ассоциация репликационных сайтов, локализованных во внутренних областях ядра, со структурами ядерного матрикса, является, таким образом, отражением транскрипционной активности эухроматина, на что указывает сходство распределения сайтов транскрипции и сайтов репликации в ранней S-фазе (Goldman et al., 1984; Wansink et al., 1994;

Hassan, 1995).

Помимо фракции ДНК, реплицируемой в центральной зоне ядра и сохраняющей свою локализацию после экстракции, не покидает пределы ядерной оболочки и ДНК гетерохроматиновых локусов, связанных с остаточным ядрышком. Положение этих доменов в экстрагированных препаратах не зависит от их репликационного статуса.

Остальные фракции хроматина покидают объем остаточного ядра, полностью мигрируя в гало. При этом зоны включения БрдУ в зоне гало сохраняют дискретность.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что ДНК в зонах репликации, выявляемых с помощью импульсного внесения предшественника синтеза ДНК 5’-БрдУ, определенным образом упакована и сохраняет достаточно компактное состояние, в поддержание которого вовлечены и гистоны, и компоненты репликационных комплексов.

Оптимизация метода выявления репликационных сайтов на ультраструктурном уровне.

Для оптимизации условий ультраструктурного анализа РС в работе было проведено тестирование нескольких различных методических подходов:

1. Клетки фиксировали и обрабатывали так же, как и для оптической микроскопии, проводили кислый гидролиз. Реакцию с антителами, конъюгированными с наночастицами золота и процедуру «серебряного усиления» осуществляли до заключения материала в эпоксидную смолу. Далее Препараты подготавливали для электронно-микроскопического исследования стандартным способом.

В контроле в ядрах клеток линии СПЭВ, фиксированных in situ на 0,1 М фосфатном буфере (буфере Зеренсена), элементы хроматина имеют вид гранул диаметром 15-30 нм, образующих скопления различной плотности. После процедуры кислого гидролиза хроматин приобретает тонко фибриллярную или волокнистую структуру. Средний диаметр фибрилл хроматина в этих условиях составляет 6-10 нм.

При импульсном введении БрдУ зерна золота располагаются кластерами неправильной формы, которые частично ассоциированны с ядерной оболочкой и периферией блоков конденсированного хроматина. Большое количество зерен золота выявляется в материале ядрышка и в цитоплазме.

2. Клетки пермеабилизовали в буфере, содержащем двухвалентные катионы (20 ммоль ТЭА, 4 ммоль MgCl2), фиксировали 3,7% формальдегидом на том же буфере, и обрабатывали так же, как описано выше. Этот метод позволяет сохранить все структурные домены ядра: хроматин, ядрышки, интерхроматиновые гранулы. Хроматин на препаратах представлен двумя типами структур – компактными блоками и фибриллами толщиной 60-100 нм с «изрезанными» поверхностями. По данным литературы, такого рода структурные комплексы хроматина соответствуют хромомерам и хромонемам (Зацепина и др., 1983).

Метка, маркирующая реплицирующийся хроматин, выявляется строго на периферии хромонем и хромомеров. Кластеры гранул золота имеют вид цепочек, лежащих параллельно фибриллам хроматина, иногда – по обеим сторонам, а также принимают форму колец, окружающих фибриллы, срезанные поперек.

3. Клетки фиксировали 1% раствором ГА на 0,1 М фосфатном буфере Зеренсена. Реакцию с антителами проводили непосредственно на поверхности ультратонких срезов после травления их поверхности 10% раствором пероксида водорода. Для визуализации использовали вторичные антитела, конъюгированные с коллоидными золотыми частицами диаметром 15 нм.

Зерна коллоидного золота в клетках, зафиксированных на фосфатном буфере Зеренсена, располагаются случайным образом относительно хроматиновых элементов, как непосредственно над электронно-плотными структурами, так и в непосредственной близости.

Отличительной особенностью такого подхода является сохранность внутриядерных и цитоплазматических структур и высокое отношение сигнала к фоновому шуму.

4. Для того, чтобы параллельно с выявлением реплицируемой ДНК, визуализировать макромолекулярные комплексы хроматина клетки, пермеабилизованные в конденсирующем буфере, содержащем ионы кальция, фиксировали 1 % раствором глютарового альдегида на том же растворе, и далее обрабатывали аналогично варианту 3.

Эффективность мечения, достигаемая при использовании методов 2 и 3, невысока. Однако низкая эффективность компенсируется полной сохранностью структур, а также очень высоким отношением сигнала к фоновому шуму.

Внутренний отрицательный контроль – ядра, не реплицирующие ДНК – подтверждает эффективность и адекватность метода. Также данный метод позволяет исключить артефакты, связанные с неспособностью антител проникать в конденсированные хроматиновые блоки.

Имеющиеся в литературе данные о конформации репликационных сайтов получены в системах, не позволяющих выявлять индивидуальные фибриллы хроматина, что связано с применением буферных растворов, диспергирующих хроматин (Jaunin et al., 2000; Philimonenko et al., 2005), или в системах, где хроматин частично удален (Hozak and Cook, 1993; Hozak et al., 1994).

Пермеабилизация клеток в растворах с низкой ионной силой в присутствие двухвалентных катионов (Кирьянов и др., 1981; Зацепина и др., 1983) позволяет не только выявлять конформации фибрилл хроматина, но и, благодаря удалению растворимых компонентов кариоплазмы, дает возможность дифференцировать зоны концентрации ДНП-материала и пространства, им обедненные, что позволяет не использовать удаление хроматина.

Визуализация зон включения БрдУ на поверхности ультратонких срезов возможна при использовании любого протокола фиксации и заключения (O’Keefe et al., 1992; Lattanzi et al., 1998), что, возможно связано с тем, что остаток БрдУ не теряет иммуногенности при заключении в смолу. Вероятно, с потерей белковыми молекулами своих антигенных свойств связана высокая специфичность данного метода.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»