WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Образцы волос сохраняли для дальнейшего анализа. На 7 сутки после эпиляций, животных умерщвляли по стандартной методике (Hogan B. et al., 1994). Эпилированные участки кожи иссекали и фиксировали в 10% формалине для дальнейшего гистологического исследования. После фиксации образцы кожи отмывали в проточной воде в течение 12 часов, проводили по стандартной бутанольной проводке и заключали в парафин, затем делали срезы на микротоме (толщина срезов 6 мкм), окрашивали срезы гематоксилином по Эрлиху и заключали в канадский бальзам. Оценку срезов производили с помощью микроскопа «Биолам Р-15» ("ЛОМО", Россия) (объективы: х10, х20, х40), а также фотографировали через микроскоп с помощью цифровой фотокамеры «CoolPix 4500» («Nikon», Япония; фотоокуляр х4).

2. Определение темпов роста, формы и геометрических параметров волоса У пяти 8-месячных самок мышей линии BALB/c эпилировали поверхность кожи на участке спины (ниже проекции лопаток), которую затем ежедневно просматривали под бинокулярным микроскопом. Момент появления кончиков прорастающих волос регистрировали на 7-8 сутки после эпиляции.

Прирост длины волос в течение первых двух дней после их появления над поверхностью кожи определяли после окрашивания краской для волос («Londacolor», черный оттенок), приготовленной и нанесенной на поверхность (2 – 3 мм2) кожи в соответствии с стандартной прописью.

После того, как волосы подрастали настолько, что их можно было захватить пинцетом (на 3-4 сутки после появления кончиков волос над поверхностью кожи), ежедневно выщипывали образцы волос. Образцы волос собирали вплоть до окончания их удлинения. Образцы окрашенных и (или) эпилированных волос без какой-либо предварительной обработки заключали в канадский бальзам на предметных стеклах.

Препараты фотографировали через микроскоп (объектив х3,2, фотоокуляр х4) с помощью цифровой фотокамеры CoolPix 4500 («Nikon», Япония). В поле зрения микроскопа вносился эталонный объект – объект-микрометр. Измерения длины волос в целом и окрашенных участков волос в частности производили на персональном компьютере по фотографиям с помощью программы анализа изображений «Plana».

Для определения геометрических параметров волоса производили поперечные срезы через отдельные завершившие рост остевые волосы, полученные от пяти самок 8месячных мышей линии BALB/c. От каждого животного брали по пять остевых волос из области ниже лопаток. Отдельные волосы без предварительной обработки заключали в эпоксидную смолу мягкой консистенции в соответствии со следующей прописью: 20,0 мл Эпона-812, 22,0 мл ДДСА, 5,0 мл МНА, 1,4 мл БДМА (был заменен на ДМП-30) (Миронов и др., 1994). Поперечные срезы блока с волосом, толщиной от 0,2 до 1,3 мм, получали с помощью лезвий для безопасной бритвы. Последовательные фрагменты волос и их поперечные сечения фотографировали через микроскоп «Биолам Р-15» ("ЛОМО", Россия) (объективы: х10, х20, х40, фотоокуляр х4) с помощью цифровой фотокамеры «CoolPix 4500» («Nikon», Япония). В качестве эталонов длины применяли объектмикрометр, площади – сетку камеры Горяева, сфотографированные при соответствующем увеличении. Измерения длины участков волос и площади их поперечных сечений производили на персональном компьютере с помощью программы анализа изображений «Plana».

Статистическая обработка полученных данных.

Для статистической оценки полученных в результате измерений данных использовали непараметрические методы (сравнение независимых и сопряженных выборок в соответствии с критериями знаков, Вилкоксона, Манна-Уитни, КолмогороваСмирнова). Сопоставление временных рядов осуществляли с помощью методов регрессионного анализа. Статистическая обработка производилась с использованием программ «Stadia», «SigmaPlot», «Statistica». Критический уровень значимости принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изменения волосяного покрова у мышей на участке кожи, подвергавшемся повторным эпиляциям Характерной особенностью мышей линии C57BL/6 является изменение окраски кожного покрова в зависимости от стадии цикла волосяного фолликула. Это явление неоднократно описывалось различными авторами и служит маркером активных стадий цикла волосяных фолликулов (Muller-Rover et al., 2001). Потемнение кожи, распространяющееся в виде волны с относительно отчетливым фронтом от краниальных и вентральных областей тела в каудальном и дорзальном направлениях, сопровождает естественное обновление волосяного покрова.

В наших опытах потемнение кожи становится заметным на пятые сутки после эпиляции, углубляется по мере прогресса анагена и достигает максимальной насыщенности к 11-12 суткам после эпиляции. На протяжении катагена кожа светлеет, и приобретает естественный розовый цвет с наступлением телогена. Такие закономерные изменения цвета кожи в области эпиляции у подопытных мышей мы наблюдали после первых трех эпиляций. После четвертой эпиляции (т.е. у 20-недельных мышей) нарушалась характерная для анагена равномерность окраски кожи: потемнение эпилированной поверхности распространялось, как правило, кранио-каудально в виде резкого фронта.

Такая пигментация сохранялась на протяжении последующих эпиляций (т.е. до 32недельного возраста), вне зависимости от инициированных эпиляциями фолликулярных циклов. Эти особенности пигментации нельзя объяснить естественным процессом обрастания, совпавшим по времени с периодическими эпиляциями. По Мюллер-Ровер (Muller-Rover et al., 2001) первая естественная волна роста волос у мышей линии C57BL/происходит в возрасте 4 недель; вторая – в возрасте 12 недель. Таким образом, можно полагать, что ритм регулярной пигментации кожи, инициированный синхронными эпиляциями, нарушается в результате экспериментального воздействия.

Помимо нарушения пигментации у подопытных животных отмечено поредение волосяного покрова на эпилируемом участке, становящееся заметным после пятой эпиляции (рис. 1).

А Б В Рис. 1. Вид шерстного покрова на эпилируемой области на спине мышей после шестого цикла эпиляции (А, Б). Вид шерстного покрова интактной мыши того же возраста (В).

Следует иметь в виду, что шерсть у контрольных животных к 8-месячному возрасту сформирована в результате трех естественных волн обрастания: в эмбриональный период и в возрасте 4 и 12 недель. У мышей не выражена фаза экзогенна, то есть телогенные волосы каждой из генераций не выпадают, а остаются погруженными в толщу кожи. Таким образом, волосяной покров 8-месячных животных контрольной группы должен быть как минимум в 3 раза гуще, чем у подопытных, у которых в результате эпиляций постоянно сохраняется одно и то же соотношение численности фолликулов и волос (1:1). Детальное рассмотрение эпилировавшихся областей, позволяет предполагать, что в этот эффект привносит свой вклад изменение состава волосяного покрова: увеличение количества тонких пушковых волос и уменьшение количества длинных и относительно толстых остевых и направляющих волос.

Динамика состава волосяного покрова мышей при последовательных эпиляциях Динамика доли пушковых волос, полученных из области ниже лопаток и области крестца у контрольных животных, не различается статистически (различия коэффициентов наклона линейных трендов недостоверны, p > 0,05; рис.2, А). Линейный тренд, характеризующий динамику пушковых волос у животных контрольной группы, имеет незначимый коэффициент наклона (p = 0,1098). В соответствии с этим, следует полагать, что доля пушковых волос на протяжении исследованного периода существования животных изменяется незначимо.

У подопытных мышей, динамика изменения доли пушковых волос закономерно возрастает (значимость свободного члена линейного тренда p < 0,0001, коэффициента наклона – p = 0,0026; рис. 2, А). Линейный тренд достоверно отличается от линейного тренда, характеризующего изменение доли пушковых волос у контрольных животных (значимость различий коэффициентов наклона p = 0,031).

Таким образом, можно с достаточной уверенностью полагать, что увеличение доли пушковых волос вызвано экспериментальным воздействием, т.е. периодической эпиляцией. Доля пушковых волос в области эпиляции фактически не изменяется спустя 196 и 264 дня после завершающей эпиляции (см. рис. 2, А).

Не найдено статистических различий между динамиками доли волос типа auchene, полученных из области ниже лопаток и области крестца (различия коэффициентов наклона линейных трендов недостоверны, p > 0,05; рис.2, Б). Линейный тренд, характеризующий динамику волос типа auchene у животных контрольной группы имеет незначимый коэффициент наклона (p = 0,3183). Следовательно, доля волос типа auchene на протяжении исследованного периода жизни животных изменяется незначимо.

Динамика изменения доли волос типа auchene у мышей подопытной группы в области ниже лопаток снижается (значимость свободного члена линейного тренда p < 0,0001, коэффициента наклона – p = 0,0009; рис.2, Б). У контрольных животных линейный тренд достоверно отличается от линейного тренда, характеризующего изменения доли волос типа auchene у подопытных животных только по коэффициентам наклона (значимость различий коэффициентов наклона p =0,0268), но не по положению прямых (значимость p=0,104).

Исходя из вышесказанного, можно предположить, что уменьшение доли волос типа auchene вызвано экспериментальным воздействием, т.е. периодической эпиляцией. Спустя 196 и 264 дня после завершающей эпиляции доля волос типа auchene в области эпиляции изменяется незначительно (см. рис.2, Б).

Между динамиками доли остевых волос, полученных из области ниже лопаток и области крестца у контрольных животных, нет статистических различий (различия коэффициентов наклона линейных трендов недостоверны, p > 0,05; рис.2, В). Линейный тренд, характеризующий динамику остевых волос у животных контрольной группы имеет незначимый коэффициент наклона (p = 0,0548). Опираясь на это, следует полагать, что на протяжении исследованного периода онтогенеза животных доля остевых волос изменяется незначимо.

А 0 100 200 300 400 Б 0 100 200 300 400 В 0 100 200 300 400 Рис. 2. Изменение доли пушковых (А), auchene (Б) и остевых (В) волос по мере последовательных эпиляций шерсти на одной и той же области (ниже лопаток) на спине мышей (ромбы, сплошная линия – тренд; вертикальные линии – стандартная ошибка средних) и тренд изменения долей соответствующих типов волос в области ниже лопаток (квадраты, крупный пунктир) и в области крестца (треугольники, мелкий пунктир) с возрастом у контрольных (не подвергавшихся эпиляции) мышей. Перекрестием указаны значения долей волос соответствующего типа у подопытных мышей спустя 196 и 264 дня после последней эпиляции. Ось абсцисс – время в сутках; ось ординат - % волос соответствующего типа.

Динамика изменения доли остевых волос в области ниже лопаток у мышей подопытной группы заметно снижается и может быть описана линейным трендом (рис.2, В), который достоверно отличается от линейного тренда, описывающего изменения доли остевых волос у мышей контрольной группы лишь положением (p = 0,00217), но не коэффициентом наклона (значимость различий p = 0,0751). В области эпиляции доля остевых волос фактически не изменяется спустя 196 и 264 дня после завершающей эпиляции (см. рис. 2 В). Направляющие волосы в силу своей малочисленности рассматриваются здесь только на рис. 3 и в комментариях к нему.

Плотность волосяного покрова у контрольных животных в области ниже лопаток и на крестце не изменяется сколько-нибудь значимо на протяжении всего периода наблюдения (коэффициенты наклона аппроксимирующих трендов незначимы).

Однако, плотность волос на крестце (44,4±1,60 на 1 мм2) значимо превосходит таковую в области ниже лопаток (38,3±1,00 на 1 мм2) (критерий знаков, p = 0,043; критерий Вилкоксона для парных значений, p = 0,0054). Вопреки отмеченному выше впечатлению, плотность волосяных фолликулов на эпилировавшейся поверхности также сохраняется относительно неизменной на протяжении всего экспериментального периода (коэффициент наклона соответствующего линейного тренда незначим).

Усредненная (для всего периода эпиляций) плотность волос на 1 мм2 эпилировавшейся поверхности (37,07±0,74) значимо отличается от средней плотности волос на крестце (критерий знаков, p = 0,0234; критерий Вилкоксона для парных значений, p =0,018), но не отличается от средней плотности волосяного покрова в области ниже лопаток (критерий знаков, p = 1,000; критерий Вилкоксона для парных значений, p =0,867).

Здесь следует добавить следующее: тщательное исследование гистологических препаратов образцов кожи подопытных животных после завершения периодических эпиляций не выявило каких-либо цистоподобных образований на месте волосяного фолликула, или фрагментов волосяных фолликулов в виде верхней части волосяного канала с ассоциированными сальными железами мы не обнаружили (описанных в работах Ibrahim, Wright, 1978; Hamilton, Potten, 1974). Эти результаты в совокупности с данными подсчета прорастающих волос после каждой эпиляции позволяют утверждать, что на протяжении последовательных эпиляций участка кожи не происходило скольконибудь значимого сокращения их плотности.

Суммарное количество пушковых, auchene, остевых и направляющих волос, сформированных волосяными фолликулами в периодически эпилировавшейся области на протяжении всего периода исследования, возрастает в высшей степени регулярно (рис. 3).

А 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Б 0 20 40 60 80 100 120 140 160 В 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Г 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Рис. 3. Суммарная продукция пушковых (А), auchene (Б), остевых (В), направляющих (Г) волос фолликулами в области ниже лопаток на протяжении периода эпиляций (точки). Сплошные линии – аппроксимация последовательностей точек. Пунктирные линии - гипотетические кумулятивные прямые, построенные на основании предположения о том, что после каждой эпиляции волосяные фолликулы формируют одинаковое количество волос соответствующего типа. Ось абсцисс – время в сутках;

ось ординат – сумма долей волос соответствующего типа в образцах эпилированной шерсти (в %).

На основании того, что численность волос на эпилировавшемся участке кожи не изменяется существенно, предположим, что каждый фолликул, после очередной эпиляции формирует стержень волоса того же типа, как и ранее. Исходя из этой посылки построим гипотетическую кумулятивную кривую, отражающую деятельность (продуктивность) фолликулов на протяжении всего периода эпиляций (см. рис. 3).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»