WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Рис.12. Тестирование промоторов и активаторов на функциональную активность в клеточной линии Sg4 D. melanogaster. По оси Y – относительная активность люциферазы светлячка, нормированная на активность люциферазы Renilla (Fluc/Rluc). По оси Х – значения люминесценции для разных конструкций. Все эксперименты проведены как минимум в трех повторах. Обозначения конструкций: ПрW, ПрY, Пр – ген люциферазы светлячка под контролем промоторов генов white, yellow, CG32795, соответственно; glass-Пр, Iab8-Пр, Ак-Пр – перед промотором гена CGвстроены активаторы glass, Iab8 и PRE Ubx, соответственно.

Вначале были протестированы промоторы двух хорошо изученных маркерных генов white и yellow, которые экспрессируются в эмбрионах D. melanogaster, и ранее часто использовались для исследования активности инсуляторов. Для этого были созданы конструкции, в которых ген люциферазы светлячка находился под контролем промоторов данных генов (конструкции ПрW и ПрY, соответственно). К сожалению, оказалось, что промоторы генов white и yellow не способны стимулировать экспрессию репортерного гена в клеточных линиях дрозофила S2 и Sg4 (рис. 12). Поэтому в анализе был использован промотор гена CG32795, который, как было показано ранее, способен эффективно активировать транскрипцию репортерного гена в S2 клетках D. melanogaster. Действительно, данный промотор эффективно функционировал не только в клеточной линии S2, но и в линии Sg4 (конструкция Пр, рис. 12). При поиске активатора, который способен усиливать транскрипцию с промотора гена CG32795, были проверены несколько известных элементов:

glass, Iab8 и элемент PRE Ubx из регуляторной области гена Ubx (конструкции glass-Пр, Iab8-Пр и Ак-Пр, соответственно). Полученные данные свидетельствуют о том, что способностью активировать транскрипцию с промотора гена CG32795 обладал лишь элемент PRE Ubx. В эмбриональной клеточной линии S2 при наличии данного активатора (конструкция Ак-Пр) уровень экспрессии гена люциферазы светлячка увеличивался примерно в 2.5-3 раза; в эмбриональной клеточной линии Sg4 – примерно в 3-3.5 раза.

Исходя из полученных данных, в дальнейших экспериментах использовалась клеточная линия Sg4.

Для проверки способности элемента PRE Ubx активировать промотор на расстоянии, были созданы конструкции, в которых между активатором и промотором располагались спейсерные участки ДНК. В качестве спейсеров были выбраны кодирующая область гена eGFP ( 700 п. н.; конструкция (Ак-(700)-Пр) и участок ДНК из фага ( 2000 п. н.;

конструкция Ак-(2000)-Пр ). Оказалось, что вставки этих фрагментов ДНК практически не снижали уровень активации промотора гена CG32795; некоторое уменьшение активации в случае конструкции Ак-(2000)-Пр можно объяснить значительным увеличением длины плазмиды ( на 25%) и, как следствие, снижением эффективности трансфекции. Таким образом, полученные данные свидетельствует о способности элемента из регуляторной области гена Ubx активировать транскрипцию при увеличении расстояния между ним и промотором.

Рис.13. Проверка способности различных инсуляторов блокировать действие активатора в описываемой тест-системе. По оси Y – относительная активность люциферазы светлячка, нормированная на активность люциферазы Renilla (Fluc/Rluc). По оси Х – значения люминесценции для разных конструкций. Все эксперименты проведены как минимум в трех повторах. Обозначения конструкций: Пр – ген люциферазы светлячка под контролем промотора гена CG32795; Ак-Пр – перед промотором гена CG32795 встроен активатор PRE Ubx; Ак-gyp-Пр, Ак-1A2-Пр, Ак-Fab8-Пр, Ак-Wari-Пр – между активатором и промотором встроены инсуляторы gypsy, 1A2, Fab8 и Wari, соответственно; Ак-(700)-Пр, Ак-(2000)-Пр – между активатором и промотором встроены спейсерные участки длиной 700 п.н. и 2000 п.н., соответственно.

Для проверки адекватности выбранной нами модельной системы были протестированы четыре хорошо изученных инсулятора D. melanogaster на способность блокировать активацию промотора гена CG32795 элементом PRE Ubx: gypsy, 1A2, Fab8 и Wari. Инсулятор Fab8 находится в регуляторной области гена AbdB и содержит два сайта связывания для белка dCTCF. Все эти инсуляторы были способны блокировать активацию промотора в созданной системе. Важно отметить, что эффективность блокирования активатора разными инсуляторами была сравнима с данными, полученными ранее на трансгенных конструкциях и описанными в литературе. Таким образом, созданная модельная система может быть использована для тестирования инсуляторов D. melanogaster.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава I. Барьерная активность и инсуляторный комплекс Wari-инсулятора.

В данной работе установлено, что Wari-инсулятор обладает сайленсер-блокирующей активностью. Так, он способен защищать гены yellow и white от репрессии сайленсера из регуляторной области гена Ubx. Как и в случае энхансер-блокирующей активности, хотя и не так эффективно, вторая копия Wari-инсулятора усиливает сайленсер-блокирующую активность этого элемента. Однако, в отличие от энхансер-блокирующей активности, сайленсер-блокирующая активность Wari-инсулятора зависит от расстояния между ним и промотором гена. Вместе с тем, участок Wari-инсулятора длиной 368 п. н. достаточен как для сайленсер-блокирующей, так и для энхансер-блокирующей активностей. Можно предположить, что зависимость от расстояния обусловлена тем, что, подобно энхансерам, Polycomb-зависимые сайленсеры обладают способностью непосредственно взаимодействовать с промотором гена white. Одним из вероятных объяснений дистанционной зависимости активности Wari-инсулятора является возможность взаимодействия с ним комплекса ремоделинга хроматина (см. ниже).

В данной работе показано, что с Wari-инсулятором in vivo взаимодействуют белки CP190 и E(y)2. Известно, что белок CP190 взаимодействует с разными инсуляторами D.

melanogaster, такими как Su(Hw), dCTCF и BEAF-зависимыми инсуляторами. E(y)участвует в сайленсер-блокирующей активности Su(Hw)-зависимых инсуляторов. Вероятно, белки CP190 и E(y)2 взаимодействуют с пока не известным ДНК-связывающим компонентом Wari-инсулятора. Результат данной работы свидетельствует о том, что E(y)2, также как и CP190, может являться общим компонентом для большого числа инсуляторов, активность которых зависит от разных ДНК-связывающих транскрипционных факторов. Важно отметить, что как и в случае Su(Hw)-зависимых инсуляторов, белок E(y)2 определяет способность Wari-инсулятора блокировать активность сайленсеров, но не энхансеров.

Недавно было показано, что E(y)2 является компонентом SAGA/TFTC-комплекса.

Вполне возможно, что E(y)2 обеспечивает присутствие этого комплекса на Wari- и Su(Hw)зависимых инсуляторах. Таким образом, сайленсер-блокирующая активность инсуляторов может определяться компонентами SAGA/TFTC-комплекса, содержащим в своем составе гистон-ацетилтрансферазы (НАТs), детерминирующие локальный статус активного хроматина. Можно предположить, что гистон-ацетилтрансферазы данного комплекса, связывающиеся с последовательностью Wari-инсулятора, могут изменять статус хроматина только на относительно небольшом расстоянии. Это может объяснить дистанционную зависимость активности Wari-инсулятора при блокировании сайленсера.

Ранее было показано, что хотя Wari-инсулятор не взаимодействует с белком Su(Hw), он способен функционально взаимодействовать с Su(Hw)-зависимыми инсуляторами, gypsy и 1А2. Наличие общих белковых компонентов данных инсуляторов может объяснить их способность к функциональному взаимодействию.

В данной работе была исследована стадиоспецифичность взаимодействий белков CP190 и E(y)2 c Wari-инсулятором. На эмбриональной и взрослой стадиях развития D.

melanogaster, также как и в культуре клеток, наблюдалось сильное обогащение белков CPи E(y)2 на последовательности ДНК Wari-инсулятора. Вместе с тем, на стадиях личинки и куколки связывания этих белков зафиксировано не было. Таким образом, вероятно, что связывание инсуляторных белков может быть стадио-специфичным. Так как белок E(y)необходим для защиты экспрессии гена yellow от репрессии на стадии куколки, то отсутствие белка E(y)2 на Wari-инсуляторе можно объяснить тем, что чувствительности метода X-ChIP не хватает для детекции связывания белка E(y)2 (также, как и CP190) с Wari-инсулятором на этой стадии в достаточно небольшом проценте клеток. Вместе с тем, нельзя исключить возможности того, что на данных стадиях эти белки экранированы другими белковыми факторами и не доступны для антител. Исходя из того, что антитела против белков CP190 и E(y)2, используемые для экспериментов X-ChIP в этой работе, являлись поликлональными, более вероятным является стадио- и тканеспецифичное связывание данных белков с Wariинсулятором. В подтверждение этого свидетельствует и тот факт, что разные культуры клеток D.melanogaster имеют разные профили связывания инсуляторных белков. Таким образом, связывание инсуляторных белков с Wari-инсулятором является ткане- и стадиоспецифичным процессом; возможно, этот процесс имеет весьма тонкую регуляцию в ходе развития D.melanogaster.

Глава II. Взаимодействие инсуляторов с промоторами генов.

Для проверки возможности прямого взаимодействия инсуляторов с промоторами генов в данной работе была разработана модельная система, основанная на неспособности GAL4-активатора стимулировать промотор гена, если сайты связывания для GAL4активатора расположены с 3'-стороны относительно данного гена. На примере генов yellow и white D. melanogaster было показано, что инсуляторы 1А2 и Wari способны взаимодействовать с промоторами соответствующих генов.

Рис.14. Способность GAL4-активатора стимулировать транскрипцию гена посредством инсулятора зависит от взаимного расположения сайтов связывания активатора и инсулятора внутри системы. А. GAL4-активатор стимулирует транскрипцию гена. Б. GAL4-активатор заблокирован инсулятором.

В данной работе показано, что способность GAL4-активатора стимулировать транскрипцию гена посредством инсулятора зависит от взаимного расположения сайтов связывания активатора и инсулятора внутри системы. Вероятнее всего, данное свойство объясняется тем, что если инсулятор находится с 3-стороны от сайтов связывания активатора, то при взаимодействии инсулятора с промотором гена, GAL4-активатор находится внутри образуемой петли (рис.14А). Если GAL4-активатор находится с 3-стороны от инсулятора, то при взаимодействии инсулятора с промотором он будет стерически вынесен за пределы петли и изолирован инсулятором (рис.14Б).

Было показано, что для взаимодействия с промотором гена yellow достаточно сайтов связывания белка Su(Hw), а, следовательно, инсуляторного комплекса.

Для прямого доказательства физического сближения участков ДНК инсуляторов и промоторов генов был использован метод иммунопреципитации хроматина. Показано, что в присутствии 1А2-инсулятора в трансгенной системе с двумя генами наблюдалось обогащение белка СР190 на минимальном промоторе гена теплового шока 70, но не на промоторе гена yellow. В случае промотора гена yellow можно предположить, что сигнала обогащения на нем не наблюдалось вследствие тканеспецифичной экспрессии этого гена.

Так, с минимального промотора гена теплового шока транскрипция идет повсеместно. Это, по-видимому, приводит к тому, что инсулятор способен взаимодействовать с данным промотором во всех типах клеток. Таким образом, можно предположить, что взаимодействие инсуляторного комплекса с промотором зависит от транскрипционного статуса промотора.

Способность инсуляторов взаимодействовать с промоторами подтверждает выдвинутую ранее гипотезу «ловушки промотора», по которой инсулятор, взаимодействуя с промотором, лишает промотор валентностей на взаимодействие с энхансером (рис.15).

Рис.15. «Ловушка» промотора. А. Энхансер стимулирует транскрипцию. Б. Энхансер не способен стимулировать транскрипцию, так как промотор заблокирован инсулятором.

Пока остается не известным, какие белковые факторы необходимы для инсуляторпромоторных взаимодействий. Можно предположить, что в этом процессе могут играть роль некие общие белки, которые связываются как с инсулятором, так и с промотором. В качестве претендентов на эту роль выступают компоненты SAGA-комплекса, такие как белок E(y)2, который, вероятно, входит в состав как промоторных, так и инсуляторных комплексов.

Глава III. Создание системы для исследования инсуляторов на клеточных линиях D. melanogaster.

Одним из основных методов исследования инсуляторов D. melanogaster является создание и анализ трансгенных организмов. В результате на анализ множества трансгенных линий тратится много времени и сил. В данной работе описывается модельная система для изучения инсуляторов на клеточных линиях D. melanogaster. Использование метода транзиентной трансфекции клеточных линий сильно сокращает затрачиваемое время на исследование инсуляторов. Адекватность системы проверена с использованием ряда инсуляторов D. melanogaster, принадлежащих к разным классам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе проведено изучение свойств инсуляторов 1А2 и Wari из областей генов yellow и white D. melanogaster. Показано, что Wari-инсулятор, также как и 1А2 (что было известно ранее), обладает сайленсер-блокирующей активностью. Несмотря на различные ДНК-связывающие компоненты, оба эти инсулятора обладают рядом общих белковых факторов, в том числе CP190 и E(y)2. При этом как для одного, так и для другого инсулятора белок E(y)2 необходим только для барьерной, но не для энхансер-блокирующей активности. Показано, что взаимодействие белков CP190 и E(y)2 с ДНКпоследовательностью Wari-инсулятора является стадиоспецифичным. С целью лучшего понимания механизма действия инсуляторов разработана трансгенная система для изучения взаимодействий инсуляторов и промоторов. Показано, что Wari-инсулятор функционально взаимодействует с промотором гена white, а 1А2-инсулятор – с промотором гена yellow. При этом для взаимодействия с промотором гена yellow достаточен только инсуляторный комплекс. Продемонстрировано, что 1А2-инсулятор способен взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе. Методом иммунопреципитации хроматина подтверждено наличие прямого взаимодействия между инсулятором 1А2 и минимальным промотором гена теплового шока 70. Для сокращения затрачиваемого времени на исследование инсуляторов разработана удобная модельная система, с помощью которой можно изучать и осуществлять поиск инсуляторов в клеточных культурах D. melanogaster.

ВЫВОДЫ 1) Показано, что Wari-инсулятор способен блокировать сайленсер из регуляторной области гена Ubx.

2) Установленно, что белки CP190 и E(y)2 взаимодействуют с Wari-инсулятором in vivo.

При этом белок E(y)2 необходим только для сайленсер-блокирующей активности Wari-инсулятора.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»