WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Пигментация глаз трансгенных линий мух, несущих конструкцию WG4(Wari), была на уровне базовой экспрессии гена white (рис.7А). Введение GAL4-активатора в трансгеннные линии мух привело к значительному усилению пигментации глаз во всех протестированных линиях, т.е. GAL4-активатор эффективно стимулировал транскрипцию гена white (рис.7А). В отсутствие Wari-инсулятора эффективной активации не наблюдалось (рис.7А). Анализ трансгенных линий мух с конструкцией WG4(Wari-R) показал, что функциональное взаимодействия инсулятора с промотором не зависит от ориентации инсулятора (рис.7Б).

Функциональное взаимодействие инсулятора с промотором было также показано и при анализе конструкций с геном yellow и 1A2-инсулятором [YG4(1A2), YG4(1A2-R)] (рис.7В, Г). В данных конструкциях уровень экспрессии гена yellow оценивался визуально по пигментации тела и крыльев мух по пятибалльной шкале: 5 – соответствует уровню пигментации дикого типа (экспрессия гена yellow при стимуляции гена энхансерами тела и крыльев), 2 соответствует базовому уровню пигментации (экспрессия гена yellow в отсутствие энхансеров), 1 соответствует отсутствию пигментации (y1 аллель – полная инактивация гена yellow), 3 и 4 – частичная активация энхансерами базовой транскрипции.

Введение GAL4-активатора в трансгеннные линии мух привело к значительному усилению пигментации тела и крыльев почти во всех протестированных линиях, т.е. GAL4активатор эффективно стимулировал транскрипцию гена yellow (рис.7В). В отсутствие 1А2инсулятора остаточная активации наблюдалась только в одной из линий (рис.7В). Анализ трансгенных линий мух с конструкцией YG4(1A2-R) показал, что функциональное взаимодействия инсулятора с промотором, как и в случае инсулятор-промоторной пары гена white, не зависит от ориентации инсулятора (рис.7Г).

Таким образом, с использованием разработанной нами системы было показано, что инсулятор Wari способен функционально взаимодействовать с промотором гена white, а 1А2-инсулятор – с промотором гена yellow.

Рис.8. Зависимость стимуляции транскрипции GAL4-активатором от порядка расположения элементов в конструкции. Все обозначения как на рис.7.

Можно предположить, что при взаимодействии инсулятора с промотором гена, ДНК между ними выпетливается, как это происходит в случае взаимодействий инсуляторинсулятор или промотор-энхансер. В случае проанализированных конструкций GAL4активатор расположен внутри петли, образуемой взаимодействующими инсулятором и промотором. Если GAL4-активатор будет расположен с 3-стороны от инсулятора, то при взаимодействии инсулятора с промотором гена, GAL4-активатор будет находиться вне образуемой петли. Для того чтобы подтвердить важность расположения регуляторных элементов в системе было сделано 4 конструкции, аналогичные описанным выше, в которых сайты связывания GAL4-активатора находились с 3-стороны от инсулятора [конструкции W(Wari)G4, W(Wari-R)G4, Y(1A2)G4, Y(1A2-R)G4] (рис.8). Результат анализа трансгенных линий мух показал, что при таком расположении элементов в системе, GAL4-активатор не способен эффективно стимулировать транскрипцию генов white и yellow ни в одной из конструкций.

3) 1А2-инсулятор способен взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе.

Известно, что несколько инсуляторов способны взаимодействовать друг с другом одновременно. Было решено проверить, может ли инсулятор одновременно взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе. Для этого была создана конструкция с геном yellow и 1A2-инсулятором (рис. 9А). В положении «голова-к-голове» относительно промотора гена yellow находился ген -галактозидазы под контролем минимального промотора гена теплового шока 70, для которого характерен низкий, но постоянный уровень транскрипции. При этом GAL4-активатор способен сильно стимулировать транскрипцию, идущую с минимального промотора гена теплового шока 70.

Сайты связывания белка активатора GAL4 находились между 1А2-инсулятором и промотором гена yellow (конструкция hL-YG4(1A2)) (рис.9А). В качестве контроля была сделана аналогичная конструкция, в которой GAL4-сайты располагались позади 1А2инсулятора (конструкция hL-Y(1A2)G4) (рис. 9Б).

Рис.9. Анализ взаимодействия инсулятора 1А2 с двумя промоторами в одной системе. Светлосерым прямоугольником обозначен ген -галактозидазы под контролем минимального промотора гена теплового шока 70 (hsp70min-lacZ), горизонтальной стрелкой указано направление транскрипции. Справа от схематического изображения конструкций и данных по экспрессии гена yellow приведены усредненные результаты измерения активности -галактозидазы, нормированные на общее количество белка в пробе. Для всех независимых линий, несущих трансгенную конструкцию (шесть линий для конструкции hL-YG4(1A2) и семь линий для конструкции hLY(1A2)G4, и их производных были проанализированы гомогенаты из 15 взрослых мух. На диаграмме представлены усредненные данные для проанализированных линий, указан разброс полученных значений. Остальные обозначения как на рис. 7.

Оказалось, что в конструкции hL-YG4(1A2) GAL4-активатор сильно стимулировал экспрессию как гена yellow, так и гена -галактозидазы (рис.9А). Вероятно, 1А2-инсулятор в этом случае непосредственно взаимодействовал с минимальным промотором гена теплового шока 70. Напротив, в контрольной конструкции hL-Y(1A2)G4 не наблюдалось эффективной активации ни гена yellow, ни гена -галактозидазы (рис. 9Б). Таким образом, 1А2-инсулятор способен одновременно взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе. Как и в случае взаимодействия инсулятора с одним промотором, ключевую роль играет порядок расположения элементов в системе.

2) Четырех сайтов связывания для белка Su(Hw) достаточно для обеспечения активации промотора гена yellow GAL4-активатором.

В составе последовательностей ДНК инсуляторов 1A2 и Wari длиной 454 п.н. и п.н., соответственно, могут находиться сайты связывания не только для инсуляторных белков. Поэтому нельзя исключать возможности того, что за взаимодействие с промотором ответственны не инсуляторные белки. Ранее было показано, что белок Su(Hw) является ДНКсвязывающим компонентом 1A2-инсулятора. Всего 1A2-инсулятор содержит 2 сайта связывания белка Su(Hw). В настоящее время известно, что основными белковыми компонентами 1A2-инсулятора являются белки Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2, необходимые для энхансер-блокирующей активности 1A2-инсулятора, и белок E(y)2, который, наравне с белком Su(Hw), участвует в барьерной активности 1A2-инсулятора. Поэтому следующей задачей было подтвердить, что именно инсуляторный белковый комплекс, собирающийся на сайтах связывания для белка Su(Hw), независимо от остальных последовательностей инсулятора, способен взаимодействовать с 5'-регуляторной областью гена yellow. Для этого вместо 1A2-инсулятора был взят четырехкратный повтор третьего сайта связывания белка Su(Hw) из инсулятора gypsy. Чтобы подтвердить, что именно четырехкратный повтор сайтов связывания белка Su(Hw) отвечает за способность GAL4-активатора стимулировать экспрессию гена yellow, он был фланкирован LOX-сайтами, позволяющими делетировать его in vivo [конструкция YG4(4xSu)] (рис.10).

Рис.10. Участок ДНК, содержащий четыре сайта связывания для белка Su(Hw), способен взаимодействовать с промотором гена yellow. Серым кругом показаны четыре сайта связывания для белка Su(Hw). Остальные обозначения как на рис.7.

Анализ трансгенных линий мух, несущих конструкцию YG4(4xSu), показал, что при наличии белка-активатора GAL4, экспрессия гена yellow усиливалась примерно так же, как и в случае присутствия 1А2-инсулятора (рис.10). Таким образом, инсуляторный белковый комплекс, собирающийся на участке ДНК с сайтами связывания для белка Su(Hw), самостоятельно способен взаимодействовать с промотором гена yellow.

4) Белок CP190 присутствует на минимальном промоторе гена теплового шока при взаимодействии промотора с 1A2-инсулятором.

Полученные данные предполагают, что инсулятор и промотор физически взаимодействуют друг с другом. Для получения дополнительного экспериментального подтверждения прямого взаимодействия между инсулятором и промотором был поставлен эксперимент с использованием метода иммунопреципитации хроматина (X-ChIP), в ходе которого проводилась оценка уровня обогащения инсуляторных белков на промоторе гена yellow. Так, если инсулятор 1А2 и промотор гена yellow взаимодействуют in vivo, то по результатам экспериментов X-ChIP на промоторе можно увидеть обогащение инсуляторных белков, которые «пришиваются» формальдегидом к ДНК-последовательности промотора.

Эксперименты проводились на двух стадиях развития D. melanogaster – личинках и куколках. Однако значимого обогащения инсуляторных белков на промоторе гена yellow обнаружено не было. Наиболее вероятным объяснением отрицательного результата является тканеспецифичная экспрессия гена yellow только в клетках эктодермы, которые составляют незначительную часть от общего числа клеток, взятых в анализ в составе личинки или куколки. Так как в клетках с неактивным геном yellow взаимодействие между инсулятором и промотором, скорее всего, отсутствует, то можно предположить, что чувствительности метода X-ChIP не хватает для идентификации статистически значимого повышения связывания инсуляторных белков с промоторной областью гена yellow.

Как известно, ген теплового шока экспрессируется повсеместно, то есть транскрипция с этого промотора идет во всех клетках. В случае, если наше предположение верно, то взаимодействие 1A2-инсулятора с минимальным промотором гена теплового шока в конструкции hL-YG4(1A2) будет реализовываться в большом числе клеток организма D.

melanogaster. Поэтому была проведена оценка связывания инсуляторных белков на минимальном промоторе гена теплового шока в конструкции hL-YG4(1A2) в присутствии и в отсутствие инсулятора 1А2 в трансгенной конструкции в одном и том же месте генома (рис.11). Для экспериментов были выбраны две независимые трансгенные линии, в одной из которых для получения хроматина использовались поздние личинки, в другой – средние куколки.

Результаты X-ChIP-экспериментов были проанализированы с помощью ПЦР в реальном времени. Праймеры для анализа результатов экспериментов были подобраны к минимальному промотору гена теплового шока в составе трансгена (pr-h). Кроме того, были проанализированы и другие участки ДНК в составе трансгена: промотор (pr-y) и кодирующая область (mid-y) гена yellow, находящаяся на удалении как от обоих промоторов, так и от инсулятора 1А2. В качестве положительного и отрицательного контролей использовались праймеры к описанной в других работах области 62D, содержащей три сильных сайта связывания для белка Su(Hw), и кодирующей области гена RpL32, соответственно. Хроматин был иммунопреципитирован с использованием антител против белка СР190, являющегося белковыми компонентом 1А2-инсулятора. В результате было показано, что сигнал обогащения присутствует только на минимальном промоторе гена теплового шока, но не на промоторе и не на кодирующей области гена yellow (рис.11). При делеции 1А2-инсулятора обогащение белка CP190 на минимальном промоторе гена теплового шока 70 исчезало, что свидетельствует о том, что данный сигнал опосредован присутствием 1A2-инсулятора в составе трансгена. Следовательно, при взаимодействии инсулятора и промотора происходит пространственное сближение этих элементов.

Рис. 11. Инсулятор 1А2 физически взаимодействует с минимальным промотором гена теплового шока 70. По оси X представлены результаты ПЦР в реальном времени с разных пар праймеров. Геномные области 62D и RpL32 – положительный и отрицательный контроли, соответственно. Остальные пары праймеров специфичны к ДНК-последовательностям в составе трансгенной конструкции. pr-h, pr-y и mid-y – проанализированные области конструкции, соответствующие минимальному промотору гена теплового шока 70 (pr-h), промотору гена yellow (pr-y) и кодирующей части гена yellow (mid-y), удаленной на расстояние около 2 т. п. н. как от промотора, так и от 1А2-инсулятора. Хроматин выделялся из поздних личинок для одной линии (А) и из средних куколок для другой линии (Б), несущих конструкцию hL-YG4(1A2), а также из производных этих линий с делетированным 1А2-инсулятором на соответствующих стадиях развития (производные hL-YG4). Иммунопреципитация проводилась с использованием антител против белка СР190 и неспецифических антител. Результаты экспериментов для конструкций и их производных нормированы на значение положительного контроля (62D). Остальные обозначения как на рис. 3.

ГЛАВА III. Создание новой системы для исследования инсуляторов D. melanogaster.

Тестирование ДНК-последовательностей на инсуляторную активность в настоящее время проводят с использованием трансгенных модельных систем, что является трудоемким, занимающим много времени процессом. Для быстрого анализа регуляторных элементов на инсуляторную активность и для обнаружения белковых компонентов инсуляторов необходимо создание эффективных экспресс-систем. Поэтому следующей задачей данного исследования было разработать быструю и удобную в использовании тест-систему для исследования инсуляторов на эмбриональных клеточных линиях D. melanogaster.

Культуры эмбриональных клеточных линий дрозофила представляют собой мало изученную систему. Поэтому, на первом этапе исследования было необходимо выбрать активаторы транскрипции и промоторы, которые способны функционировать в данных клеточных линиях. Для идентификации активности исследуемых регуляторных элементов были использованы гены люциферазы светлячка и люциферазы Renilla. Уровень экспрессии данных генов легко оценивать по эффективности люминесценции, измеряемой при определенных длинах волн. Для введения генов люцифераз, находящихся под контролем различных регуляторных элементов, в клетки эмбриональных линий D. melanogaster применялся метод транзиентной трансфекции. Плазмидный вектор, содержащий ген люциферазы светлячка без промотора, использовался для подбора необходимых регуляторных элементов тест-системы. Для контроля уровня эффективности трансфекции клетки были котрансфецированы плазмидным вектором, содержащим кодирующую часть гена люциферазы Renilla под контролем актинового промотора. Специфический сигнал определялся по отношению активности люциферазы светлячка к активности люциферазы Renilla (Fluc/Rluc).

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»