WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

В отличие от гена yellow, Wari-инсулятор в обеих конструкциях, [(PRE)(Wari)YW] и [(PRE)(Wari)YW], практически не защищал ген white от репрессии сайленсером. Делеция Wari-инсулятора показала, что он был активен только в двух из семи линий мух, несущих конструкцию [(PRE)(Wari)YW] и в двух из девяти линий с конструкцией [(PRE)(Wari)YW].

В проанализированных конструкциях ген yellow находился на расстоянии 893 п.н. от Wari-инсулятора; ген white был удален от тестируемого Wari-инсулятора на расстояние около 5 т.п.н. (длина гена yellow). Для того чтобы проверить, влияет ли расстояние между Wari-инсулятором и промотором репортерного гена на способность защищать данный промотор от репрессии были сделаны две конструкции, в которых тестируемый Wariинсулятор был встроен между генами yellow и white [конструкции (PRE)Y(Wari)W (рис.1В) и (PRE)Y(Wari)W (рис.1Г)]. Расположение остальных элементов соответствовало первым двум конструкциям. В конструкции [(PRE)Y(Wari)W] Wari-инсулятор за геном white был удален (рис.1Г).

В трансгенных линиях, несущих конструкцию [(PRE)Y(Wari)W] экспрессия гена white была защищена от репрессии сайленсером во всех линиях, что было подтверждено делецией Wari-инсулятора (рис. 1В). В конструкции [(PRE)Y(Wari)W] Wari-инсулятор защищал экспрессию гена white только в 50% линий, что свидетельствует о том, что Wari-инсулятор, расположенный за геном white, необходим для эффективного блокирования сайленсера PRE (рис.1Г). В обеих конструкциях ген yellow был зарепрессирован, так как не был защищен инсулятором (рис.1В, Г). Таким образом, сайленсер-блокирующая активность Wariинсулятора зависит от расстояния между ним и защищаемым промотором. При этом, в случае, когда два Wari-инсулятора фланкировали ген white, для сайленсер-блокирующей активности была важна вторая копия инсулятора.

2) Фрагмент Wari-инсулятора длиной 368 п.н. достаточен для энхансерблокирующей и сайленсер-блокирующей активностей инсулятора.

Ранее была установлена функциональная область Wari-инсулятора длиной 368 п.н., необходимая для энхансер-блокирующей активности. Для того чтобы проверить, является ли данная область достаточной для сайленсер-блокирующей активности Wari-инсулятора, были протестированы разные ДНК-фрагменты Wari-инсулятора на способность защищать экспрессию гена yellow от сайленсер-опосредованной репрессии. Фрагменты инсулятора исследовались в конструкциях, которые были аналогичны конструкции (PRE)(Wari)YW (рис.2А). Тестируемые фрагменты были фланкированы LOX-сайтами и вставлены в положение -893 относительно начала транскрипции гена yellow между сайленсером и промотором гена yellow. Способность фрагментов Wari-инсулятора блокировать сайленсеропосредованную репрессию во всех конструкциях была подтверждена их делецией в трансгенных линиях. Всего было протестировано три фрагмента Wari-инсулятора:

функциональная область Wari-инсулятора длиной 368 п.н., необходимая для энхансер блокирующей активности; 3-область полноразмерного Wari-инсулятора длиной 191 п.н.;

фрагмент длиной 215 п.н., являющийся частью 368 п.н. фрагмента (рис.2Б).

В 10 из 11 линий, несущих трансгенную конструкцию с 368 п.н. Wari-инсулятором (PRE)(W368)YW, экспрессия гена yellow в щетинках была эффективно защищена от репрессии сайленсером (рис.2Б). В то же время, ни укороченный фрагмент 215 п.н., обладающий слабой способность блокировать энхансеры, ни 191 п.н. 3-область Wariинсулятора анти-сайленсерной активностью не обладали. Таким образом, функциональный участок Wari-инсулятора длиной 368 п.н. достаточен не только для энхансер-блокирующей, но и для сайленсер-блокирующей активности инсулятора.

Рис. 2. Функциональная область Wari-инсулятора, отвечающая за сайленсер-блокирующую активность. А) Модельная система для тестирования ДНК-фрагментов Wari-инсулятора на способность блокировать сайленсер PRE Ubx. Б) Тестирование различных областей Wari-инсулятора на сайленсер-блокирующую активность. Цифрами обозначено положение анализируемых ДНКфрагментов относительно старта транскрипции гена mini-white в плазмидном векторе pCaSpeR.

Сверху схематически изображенных фрагментов обозначена их длина. «+» – фрагменты, обладающие энхансер- или сайленсер-блокирующей активностью; «–» – фрагменты, не обладающие соответствующей активностью. Из/Пр – отношение числа линий, в которых наблюдалось изменение (Из) пигментации при удалении исследуемого элемента, к общему числу проанализированных линий (Пр). * - данные по энхансер-блокирующей активности Wari-инсулятора, полученные ранее в нашей лаборатории.

3) Инсуляторные белки E(y)2 и CP190 взаимодействуют с Wari-инсулятором in vivo.

Ранее было показано, что известные ДНК-связывающие инсуляторные белки, Su(Hw), dCTCF, Zw5 и GAF не взаимодействуют с последовательностью ДНК Wari-инсулятора. В тоже время, Wari-инсулятор способен функционально взаимодействовать с Su(Hw)зависимыми инсуляторами gypsy и 1А2. Возможным объяснением этих результатов является наличие общих белковых компонентов у данных инсуляторов. Одним из кандидатов является белок CP190, который не связывается с ДНК напрямую. В настоящее время показано, что он взаимодействует c Su(Hw)-, CTCF- и BEAF-зависимыми инсуляторами.

Вторым потенциальным компонентом белкового комплекса Wari-исулятора является белок E(y)2/Sus1, необходимый для сайленсер-блокирующей активности Su(Hw)-зависимых инсуляторов. Белок E(y)2/Sus1 может рекрутироваться на инсуляторах путем взаимодействия с ДНК-связывающим белком инсуляторного комплекса.

Поэтому следующей задачей данного исследования стала проверка взаимодействия инсуляторных белков E(y)2 и CP190 с последовательностью Wari-инсулятора с помощью метода иммунопреципитации хроматина (X-ChIP).

Прежде всего, было проверено, взаимодействуют ли данные белки с Wariинсулятором на эмбриональной клеточной линии D. melanogaster S2. Хроматин был иммунопреципитирован с использованием антител против E(y)2 и CP190, либо против неспецифических антител (рис.3). Результаты экспериментов X-ChIP детектировались с помощью метода ПЦР в реальном времени. Во всех приведенных данных сигнал преципитации с неспецифическими антителами вычтен из представленных результатов. В качестве положительного контроля был выбран известный инсулятор gypsy, взаимодействующий с данными белками, в качестве отрицательного – кодирующая область гена ras. В результате анализа экспериментов по иммунопреципитации хроматина с помощью данных антител было выявлено обогащение ДНК-последовательности Wariинсулятора (рис.3). Таким образом, белки E(y)2 и CP190 связываются с последовательностью Wari-инсулятора в культуре клеток S2 in vivo.

Рис.3. Иммунопреципитация хроматина, выделенного из культуры клеток S2 D. melanogaster.

По оси Х – анализ экспериментов X-ChIP с разных геномных областей. По оси Y – процент обогащения различных последовательностей относительно Input. Здесь и далее в рисунках с данными по иммунопреципитации хроматина показаны усредненные результаты трех экспериментов с учетом среднеквадратичных отклонений. Использованы антитела против белков E(y)2 и CP190. ras – отрицательный контроль, gypsy – положительный.

На следующем этапе было проверено связывание белков E(y)2 и CP190 с Wariинсулятором на разных стадиях развития D. melanogaster (рис.4). В качестве материала для экспериментов X-ChIP были выбраны 4 стадии: эмбриона (0-16 часов после откладки яиц), поздней личинки, средней куколки и имаго. Для всех стадий использовались мухи дикого типа. В качестве положительного контроля были выбраны инсулятор gypsy и 1A2, в качестве отрицательного – кодирующие области генов ras и RpL32 (рис.4). Оказалось, что обогащение ДНК-последовательности Wari-инсулятора при иммунопреципитации хроматина с использованием антител против E(y)2 и CP190 наблюдалось только на эмбриональной и взрослой стадиях (рис.4). Таким образом, взаимодействие белков E(y)2 и CP190 с Wariинсулятором может быть стадио-специфичным.

Рис.4. Связывание белков E(y)2 и CP190 с Wari-инсулятором на разных стадиях развития D.

melanogaster. По оси Y – процент обогащения различных последовательностей относительно Input.

По оси X – анализ экспериментов X-ChIP с разных геномных областей на разных стадиях. ras и RpL32 – отрицательные контроли, gypsy и 1A2 – положительные. Иммунопреципитация с использованием антител против CP190 (А) и E(y)2 (Б).

Чтобы продемонстрировать, что белки E(y)2 и CP190 взаимодействуют с 368 п.н.

функциональным участком Wari-инсулятора была выбрана трансгенная линия мух (PRE)(W368)YW, несущая 368 п.н. Wari-инсулятор между PRE и промотором гена yellow. В качестве положительного контроля был выбран инсулятор 1A2, в качестве отрицательного контроля были выбраны кодирующие области генов RpL32 и yellow (mid-y) (рис.5).

Эффективное обогащение наблюдалось только для области 368 п.н. Wari-инсулятора в составе трансгена, но не для кодирующих областей протестированных генов (рис.5). Таким образом, белки E(y)2 и CP190 взаимодействуют с 368 п.н. функциональным участком Wariинсулятора.

Рис.5. Связывание белков E(y)2 и CP190 с 368 п.н. функциональной областью Wari-инсулятора в составе трансгенной конструкции. Иммунопреципитация с использованием антител против CP190 (А) и E(y)2 (Б). Хроматин был выделен из гомозиготной линии мух D. melanogaster на стадии имаго, несущей конструкцию PRE(W368)YW. По оси Y – процент обогащения различных последовательностей относительно Input. По оси X – анализ экспериментов X-ChIP с разных геномных областей на разных стадиях. W368 – 368 п.н. функциональная область Wari-инсулятора в составе трансгена; mid-y - кодирующая область гена yellow, входящего в состав трансгена; RpL32 – отрицательный контроль; 1A2 – положительный контроль.

5) Снижение уровня экспрессии гена e(y)2 влияет на PRE-блокирующую, но не на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора in vivo.

Чтобы выяснить роль белка E(y)2 в активности Wari-инсулятора, влияние мутации гена e(y)2 было проверено генетически. Для этого использовалась мутация e(y)2u1, полученная инсерцией мобильного элемента Stalker в предпромоторную область гена e(y)2 и приводящая к трехкратному снижению экспрессии данного гена.

Влияние мутации e(y)2u1 было проанализировано на трансгенных линиях, содержащих конструкцию (PRE)(Wari)YW или конструкцию (PRE)(W368)YW (рис.6). Оказалось, что в четырех из семи проанализированных линий с конструкцией (PRE)(Wari)YW и в шести из проанализированных линий с конструкцией (PRE)(W368)YW, мутация e(y)2u1 ослабляла способность Wari-инсулятора блокировать сайленсер (рис.6). В то же время, данная мутация не влияла на пигментацию щетинок в производных линиях с делецией либо Wariинсулятора, либо сайленсера, что свидетельствует о прямом влиянии мутации e(y)2u1 на функционирование Wari-инсулятора (рис.6). Дополнительно было протестировано влияние данной мутации на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора. Были протестированы линии, полученные ранее в нашей лаборатории и содержащие Wariинсулятор или функциональную область Wari-инсулятора между тканеспецифичными энхансерами и промоторами генов yellow и white. Однако данная мутация не влияла на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора.

Таким образом, мутация гена e(y)2 влияет только на PRE-блокирующую, но не на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора.

Рис. 6. Влияние мутации гена e(y)2 на сайленсер-блокирующую активность Wari-инсулятора.

Все обозначения как на рис.1. и рис.5., кроме того, что под фенотипами исходных линий мух и их производных указаны фенотипы данных линий, несущих мутацию e(y)2u1. Мутация e(y)2u1 вызвана инсерцией мобильного элемента Stalker в предпромоторную область гена e(y)2 и приводит к трехкратному снижению экспрессии гена e(y)2.

ГЛАВА II. Изучение взаимодействия между инсуляторами и промоторами у D.

melanogaster.

1) Wari- и 1A2-инсуляторы функционально взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно.

Несмотря на большое количество данных о функционировании инсуляторов до сих пор остается не ясным вопрос о механизме действия регуляторных элементов этого класса.

Одно из возможных объяснений явления инсуляции заключается в том, что инсуляторы напрямую взаимодействуют с промоторами генов.

Для проверки возможности физического сближения инсуляторов с промоторными областями генов нами была разработана модельная система, основанная на неспособности белка-активатора дрожжей GAL4 стимулировать промотор гена-мишени в случае, если его сайты связывания находятся на большом расстоянии от промотора. В качестве тестируемых пар промотор-инсулятор нами были выбраны: промотор гена yellow и 1A2-инсулятор;

промотор гена white и Wari-инсулятор. Были созданы конструкции двух типов: с геном yellow и инсулятором 1A2, с геном white и инсулятором Wari (рис.7). С 3- стороны от генов были встроены 10 сайтов связывания белка-активатора GAL4. В этих конструкциях 1A2- и Wari-инсуляторы, фланкированные LOX-сайтами, были расположены за генами и сайтами для белка-активатора дрожжей в ориентации, соответствующей их расположению в геноме [конструкции WG4(Wari), YG4(1A2)] (рис.7 А, 7В). В данной системе в случае наличия функционального взаимодействия между тестируемыми парами регуляторных элементов предполагалось, что GAL4-активатор будет приближаться к промотору гена и активировать транскрипцию. Для того чтобы проверить влияние ориентации инсулятора в системе были дополнительно сделаны 2 конструкции [конструкции WG4(Wari-R), YG4(1A2-R); здесь и далее сокращение «R» означает обратную ориентацию инсулятора относительно внутригеномной (рис.7Б, 7Г). Для экспрессии белка-активатора GAL4, трансгенные линии мух скрещивались с линией мух, несущей ген GAL4-активатора под постоянно и повсеместно функционирующим тубулиновым промотором.

Рис.7. Исследование инсулятор-промоторных взаимодействий с использованием разработанной модельной системы. Серым и черным пятиугольниками обозначены инсуляторы 1А2 и Wari, соответственно; острый угол указывает направление элемента относительно его внутригеномной ориентации по отношению к генам yellow и white, соответственно. Белым овалом обозначены сайтов связывания для активатора дрожжей GAL4. “+ GAL” – результат скрещивания трансгенных линий мух с линией, экспрессирующей белок-активатор дрожжей GAL4. Пигментация тела и крыльев, зависящая от уровня экспресии гена yellow: 1 – отсутствие пигментации; 5 – уровень пигментации, соответствующий энхансер-зависимой экспрессии гена; 2-4 – промежуточные уровни.

Цифры в строках – число линий с соответствующей пигментацией. Остальные обозначения как на рис.1.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»