WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

УДК 577.214.4:575.22 ЕРОХИН МАКСИМ МАКСИМОВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АКТИВНОСТЕЙ ИНСУЛЯТОРОВ ИЗ РЕГУЛЯТОРНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОВ YELLOW И WHITE У D. MELANOGASTER Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН

Научный консультант: академик РАН, доктор биологических наук, профессор П.Г. Георгиев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Е. Н. Набирочкина доктор биологических наук, профессор М. В. Глазков

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится 27 октября 2009 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу:

119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул.

Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан 24 сентября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук Л.С. Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Транскрипция является ключевым этапом, на котором контролируется уровень экспрессии генов. Инициация и регуляция транскрипции ДНК у высших эукариот с участием РНК-полимеразы II зависит от множества факторов: от цисдействующих регуляторных ДНК-последовательностей и транс-действующих белков. Цисдействующие регуляторные ДНК-последовательности включают энхансеры, сайленсеры, базальный промотор, инсуляторы. Энхансеры – ДНК-последовательности, представляющие собой сайты связывания белков-активаторов транскрипции. Энхансеры высших эукариот могут располагаться на разном расстоянии от промотора контролируемого ими гена. Так, некоторые энхансеры способны активировать гены на больших расстояниях, достигающих нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. Энхансеры действуют вне зависимости от положения относительно направления транскрипции гена. Сайленсеры – элементы, оказывающие негативное влияние на транскрипцию генов; на них собираются белковые комплексы, подавляющие экспрессию генов. К сайленсерам относятся ДНК-элементы для сборки комплекса белков группы Polycomb (PRE – Polycomb Response Element). Так же как и энхансеры, сайленсеры действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия. Предполагается, что важная роль в контроле специфичности действия энхансеров и сайленсеров принадлежит инсуляторам. В настоящее время сформулированы два независимых критерия, по которым регуляторный элемент может быть отнесен к инсуляторам: способность блокировать энхансеры и служить барьером между транскрипционно активным хроматином и гетерохроматином. Инсуляторы блокируют активность энхансера, но это происходит только в том случае, если инсулятор находится между энхансером и промотором гена. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера и промотора, то есть энхансер сохраняет способность влиять на незаблокированный инсулятором промотор, а промотор может быть активирован другим энхансером. Для некоторых инсуляторов показана способность блокировать репрессию, опосредованную сайленсерами.

В настоящее время существует две группы моделей функционирования инсуляторов.

Модели первой группы предполагают физическое прикрепление белков, взаимодействующих с ДНК-последовательностью инсулятора либо к ядерному матриксу, либо к ядерной оболочке и/или стабильные взаимодействия между белковыми компонентами инсуляторов, что приводит к образованию петель, являющихся независимыми доменами транскрипции генов. Модели второй группы постулируют, что инсуляторы блокируют передачу (прием) сигнала от энхансера к промотору. Предполагается существование нестабильных взаимодействий между белками, взаимодействующими с инсуляторами и белками других регуляторных элементов (энхансеров или промоторов).

Несмотря на большое количество накопленной информации, ни одна из этих моделей не может объяснить все свойства инсуляторов. Становится очевидным, что как дальнейшее изучение многообразия инсуляторов, так и изучение их функциональных свойств необходимо для понимания механизма их действия и роли в регуляции транскрипции.

Данная работа посвящена изучению свойств Wari- и 1A2-инсуляторов D.

Wari-инсулятор находится между расположенными друг за другом melanogaster. В геноме генами white и CG32795, в непосредственной близости от 3'-конца гена white. 1A2-инсулятор был обнаружен между геном yellow и achaete-scute генным комплексом, в непосредственной близости от 3'-конца гена yellow. В данной работе показано, что Wari-инсулятор обладает сайленсер-блокирующей активностью. Продемонстрировано, что Wari- и 1A2-инсуляторы взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно. Разработана новая модельная система для тестирования ДНК-последовательностей на инсуляторную активность.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью работы явилось изучение свойств Wari- и 1A2-инсуляторов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) Выяснить способность Wari-инсулятора блокировать сайленсер из регуляторной области гена Ubx.

2) Определить входят ли инсуляторные белки CP190 и E(y)2 в состав белкового комплекса Wari-инсулятора.

3) Выяснить возможность взаимодействия Wari- и 1A2-инсуляторов с промоторами генов white и yellow, соответственно.

4) Разработать модельную систему для тестирования ДНК-последовательностей на инсуляторную активность в клеточных культурах D. melanogaster.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. В работе впервые показано наличие у Wari-инсулятора сайленсер-блокирующей активности. Показано, что инсуляторные белки CP190 и E(y)2 являются белковыми компонентами Wari-инсулятора.

Продемонстрировано прямое участие E(y)2 в сайленсер-блокирующей, но не в энхансерблокирующей активности Wari-инсулятора. В данной работе показано, что инсуляторы Wari и 1A2 взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно. Разработана новая модельная система для быстрого анализа ДНК-последовательностей на наличие инсуляторной активности. Результаты данной работы позволяют объяснить механизм действия инсуляров через их способность непосредственно взаимодействовать с промоторами генов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы были представлены на международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2008» (7-11 апреля 2008 года) и «Ломоносов-2009» (13-18 апреля 2009 года); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-мая 2008 года); на 13-ой международной конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009); на международных конференциях 9th Young Scientist Forum Labyrinth of cells and molecules (YSF, Prague) July 2-4 2009 and 34rd FEBS Congress "Life’s Molecular Interactions", Prague, Czech Republic, 4-9 july, 2009; EMBO conference Nuclear Structure and Dynamics, France, Isle sur la Sorgue, 30 Sept - 4 Oct, 2009.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Из них статей – 1, тезисов устных и стендовых сообщений на конференциях – 7.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 136 страницах, содержит рисунка и 2 таблицы, состоит из введения, обзора литературных данных, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 144 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА I. Изучение сайленсер-блокирующей активности Wari-инсулятора D.

melanogaster.

1) Wari-инсулятор обладает сайленсер-блокирующей активностью Исследование способности Wari-инсулятора блокировать Рс-G-зависимые сайленсеры проводилось на ранее разработанной модельной системе в трансгенных линиях D.

melanogaster. Для этого конструкции, содержащие необходимый набор регуляторных элементов, были фланкированы 5'- и 3'-концами P-элемента, включающими концевые инвертированные повторы, необходимые для интеграции конструкций в геном D.

melanogaster.

Для изучения сайленсер-блокирующей активности Wari-инсулятора был использован известный сайленсер размером 660 п. н. из регуляторной области гена Ultrabithorax (PRE Ubx). Известно, что с этим участком in vivo связываются белки группы Polycomb.

Распространение гетерохроматина, обусловленное присутствием PRE Ubx, приводит к репрессии промоторов генов в составе трансгена. В качестве репортерных генов использовались гены yellow и white. Ген white отвечает за пигментацию глаз, ген yellow – за пигментацию кутикулярных структур личинки и имаго.

В модельной системе присутствовали энхансеры, определяющие экспрессию гена yellow в кутикуле тела, в крыловых пластинках и в щетинках (далее энхансеры тела (B), крыльев (W) и энхансер щетинок (Br)). Энхансеры тела и крыльев гена находились с 5стороны от гена yellow, энхансер щетинок – в интроне гена yellow. Сайленсер был встроен между энхансерами тела и крыльев в положение –1870 по отношению к старту транскрипции гена yellow. Wari-инсулятор длиной 825 п.н. был встроен в положение –893 по отношению к старту транскрипции гена yellow между сайленсером и промоторами расположенных друг за другом генов yellow и white [(PRE)(Wari)YW] (рис.1А). Известно, что взаимодействие между двумя копиями Wari-инсулятора усиливает энхансер-блокирующую активность данного элемента. Для того чтобы оценить влияние взаимодействия Wari-инсуляторов на блокирование PRE, была сконструирована вторая конструкция, в которой Wari-инсулятор, находящийся за геном white, был делетирован [(PRE)(Wari)YW] (рис.1Б).

В данной системе сайленсер был фланкирован FRT-сайтами для сайт-специфической рекомбиназы Flp, тестируемый Wari-инсулятор LOX-сайтами для сайт-специфической рекомбиназы Cre. Индукция сайт-специфической рекомбинации между FRT-сайтами (LOXсайтами) позволяет удалить фланкированный этими сайтами участок in vivo, в результате чего можно сравнить экспрессию генов в присутствии и в отсутствие тестируемого элемента в одном и том же месте генома.

При таком расположении элементов в модельной системе, в случае присутствия у тестируемого фрагмента ДНК сайленсер-блокирующей активности, он будет защищать экспрессию гена yellow в щетинках и экспрессию гена white в глазах мух, в то время как экспрессия гена yellow в теле и крыльях будет подвержена репрессии, так как данные энхансеры не защищены инсулятором.

Уровень экспрессии гена yellow в щетинках оценивался путем визуального анализа пигментации щетинок по шкале, в которой 5 соответствует уровню пигментации дикого типа, 1 соответствует отсутствию пигментации (инактивация гена yellow), var – вариабельная пигментация (пигментирована только часть щетинок). Экспрессия гена white оценивалась путем визуальной оценки пигментации глаз по стандартной шкале: красная окраска является пигментацией глаз мух дикого типа (экспрессия гена white при стимуляции тканеспецифичным энхансером); желтая и темно-желтая окраска – среднестатистическое проявление базовой пигментации (экспрессия гена white в отсутствие тканеспецифичного энхансера), белая окраска глаз наблюдается в отсутствие пигментации (полная инактивация гена white).

Так как используемый сайленсер функционально активен только в 50% трансгенных линий, для анализа были выбраны линии, в которых экспрессия гена yellow в теле и в крыльях исчезала после делеции сайленсера. Фенотипический анализ проводился на трансгенных самцах в линиях гетерозиготных по конструкции в присутствии и в отсутствие сайленсера или Wari-инсулятора (рис.1А, Б).

Рис. 1. Сайленсер-блокирующая активность Wari-инсулятора. Конструкции: А - (PRE)(Wari)YW, Б - (PRE)(Wari)YW, В - (PRE)Y(Wari)W, Г - (PRE)Y(Wari)W. (А-Г) Сверху представлена схема конструкции, под схемой суммированы результаты по анализу фенотипов трансгенных линий мух в щетинках (yellow) и глазах (white), несущих данную конструкцию и ее производных. Обозначения:

cерые и белые прямоугольники – гены yellow и white, соответственно, горизонтальные стрелки указывают направление транскрипции генов. White – Wari-инсулятор делетирован за геном white.

PRE – сайленсер из регуляторной области гена Ubx. Серые круги – тканеспецифичные энхансеры гена yellow, обеспечивающие высокий уровень экспрессии в крыльях (W), теле (B) и щетинках (Br).

Черный пятиугольник – Wari-инсулятор; острый угол указывает его ориентацию в трансгенной конструкции относительно его ориентации в геноме за геном white. Вертикальными стрелками отмечены сайты FRT и LOX для сайт-специфических рекомбиназ Flp и Cre, соответственно.

Пигментация глаз, зависящая от уровня экспрессии гена white: Кр – красный; тКор – темнокоричневый; Кор – коричневый; тОр – темно-оранжевый; Ор – оранжевый; тЖ – темно-желтый; Ж – желтый; сЖ – светло-желтый; Б – белый. Пигментация щетинок, зависящая от уровня экспрессии гена yellow: 1 – отсутствие пигментации, var – вариабельная окраска, окрашена только часть щетинок;

5 – уровень пигментации, соответствующий энхансер-зависимой экспрессии гена. Цифры в строках – число линий с соответствующей пигментацией. Из/Пр – отношение числа линий, в которых наблюдалось изменение (Из) пигментации при удалении исследуемого элемента, к общему числу проанализированных линий (Пр). Серым курсором на цифровой панели указано среднее значение фенотипов в проанализированных линиях мух.

Анализ трансгенных линий мух, несущих конструкцию [(PRE)(Wari)YW] (рис.1А) показал, что Wari-инсулятор эффективно защищает транскрипцию гена yellow. Так, пигментация щетинок большинства линий мух в присутствии Wari-инсулятора соответствовала энхансер-зависимой экспрессии гена yellow, при делеции Wari-инсулятора во всех линиях происходила репрессия гена yellow в щетинках (рис.1А). Отсутствие второй копии Wari-инсулятора [(PRE)(Wari)YW] незначительно повлияло на сайленсерблокирующую активность тестируемого Wari-инсулятора в отношении гена yellow (рис.1Б).

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»