WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Спектр антител в непрямом гетерогенном ИФА оценивали по стандартной методике с использованием антигенных детерминант, полученных сотрудниками ГНЦ ПМБ, пероксидазы и орто-фенилендиамина.

Токсиннейтрализующую активность иммуноглобулиновых препаратов определяли в стандартном MTT-тесте на культуре клеток J774A.1 с использованием антигенных детерминант B. anthracis, полученных сотрудниками ГНЦ ПМБ.

Индекс превентивных свойств (ПС) концентрата иммуноглобулинов изучали в эксперименте на 31 молодой белой беспородной мыши обоего пола массой от до 12 г. Животным опытной группы вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл исследуемого раствора, первой контрольной группы – по 0,5 мл стерильного 0,9 % водного раствора хлорида натрия. Животных второй контрольной группы оставляли интактными. Через 3 - 3,5 часа осуществляли подкожное заражение животных опытной и второй контрольной групп тест-дозой спор штамма СТИ-B. anthracis в объёме 0,2 мл. Результаты учитывали через 4 суток.

Профилактическую эффективность ВВИГ оценивали на 18 беспородных морских свинках обоего пола массой от 250 до 300 г. Животным опытной группы вводили подкожно по 4 мл исследуемого образца, группы сравнения – по 2 мл «Глобулина противосибиреязвенного лошадиного жидкого» серии производства ЦНИИ МО. Животных контрольной группы оставляли интактными.

Через 24 часа осуществляли подкожное заражение животных всех трёх групп 50 LD50 культуры тест-штамма 71/12 B. anthracis в объёме 1 мл. За животными наблюдали в течение 10 суток от момента заражения. Специфичность гибели животных в течение срока наблюдения определяли путём высева отпечатков паренхиматозных органов (печени, селезенки) на чашки с плотной питательной средой Хоттингера с последующей микроскопической оценкой выросших колоний.

Терапевтическую эффективность ВВИГ изучали в остром опыте на кроликах. В экспериментах использовали животных массой от 2,0 до 2,5 кг, беспородных, обоего пола. Для подкожного заражения животных применяли дозы 10 и 100 LD50 тест-штамма Ч-7 B. anthracis в объёме 1 мл. Лечение животных начинали через 24 ч после заражения. Количество вводимых препаратов рассчитывали на основании максимальных рекомендованных для человека терапевтических доз и коэффициента отношения массы и поверхности тела человека и кролика. Иммуноглобулин человека вводили внутривенно 1 раз в сутки, «Глобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий» серии производства ЦНИИ МО – внутримышечно 1 раз в сутки, антибиотик – внутримышечно 2 раза в сутки. Лечение продолжали в течение 5 суток.

Специфичность гибели животных определяли, как описано выше.

Статистический анализ проводили с использованием программ «Excel» («Microsoft», США) и «Biostat» (McGraw Hill). Принятое значение уровня значимости равно 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Установление достаточного уровня антител в противосибиреязвенном внутривенном иммуноглобулине и иммунной плазме В связи с отсутствием сведений о выделении антител человека к ПА B. anthracis из плазмы был проведён лабораторный опыт фракционирования иммунного сырья. Для опыта случайным образом было отобрано 9 порций плазмы общим объёмом 2745 мл, заготовленной от пяти доноров, иммунизированных сухой формой комбинированной сибиреязвенной вакцины.

Целевые антитела в ходе предварительных исследований специфической активности крови доноров были выявлены в титре не ниже 1:400.

На каждой стадии фракционирования отбирали образцы технологических растворов, в которых определяли содержание целевых антител и концентрацию белка. Усреднённые результаты исследования представлены в табл. 1. В связи с вариабельностью концентрации белка в образцах, с целью корректного сравнения специфической активности, был вычислен удельный показатель – приведённый титр - частное обратного титра раствора и концентрации белка в процентах.

Таблица Специфическая активность технологических растворов на этапах фракционирования иммунной плазмы Средний Средняя Средний Технологический раствор обратный концентрация приведённый титр белка, % титр Фильтрат плазмы 467 4,1 Супернатант А8 429 3,6 Супернатант А нет 2,4 нет Супернатант А1 нет 0,3 нет Супернатант Б нет 0,4 нет Супернатант В нет 0,0 нет Концентрация белка при осаждении фракции А8 уменьшалась в среднем на 12,2 %, при этом приведённый титр растворов увеличивался на 9 %, что свидетельствует о почти полном переходе антител к ПА в полупродукт супернатант А8. Целевые антитела в супернатанте А не были обнаружены, несмотря на значимую концентрацию белка в образцах, что является доказательством их полного осаждения в полупродукте фракции А. В полупродукте супернатанте Б, а также в отходах супернатантах А1 и В антитела не удалось обнаружить, по-видимому, вследствие предельно низкой концентрации белка.

Полученные концентраты иммуноглобулинов визуально были оценены как бесцветные, слабо опалесцирующие. В иммуноэлектрофорезе (ИЭФ) выявлена интенсивная дуга преципитации IgG и дополнительная дуга преципитации альбумина, в электрофорезе (ЭФ) – в среднем 94,4 % фракции -глобулинов и 5,6 % фракции альбумина. Средний приведённый титр образцов в 2,3 раза превышал аналогичный показатель исходной плазмы. Результаты опыта позволяют сделать заключение о стабильности антител к ПА B. anthracis в процессе фракционирования.

Высоким уровнем противосибиреязвенного иммунитета является 75 % выживаемость, что соответствует индексу ПС 0,4 [Бургасов П.Н. и соавт., 1965, Бургасов П.Н. и соавт., 1972]. При этом существует строгая корреляция между ПС и уровнем антител к ПА: индекс 0,4 соответствует титру 1:1600 5 % белкового раствора [Елагин Г.Д. и соавт., 1997]. Следовательно, минимальным содержанием антител в противосибиреязвенном ВВИГ, номинальная концентрация белка в котором равна 5 %, можно считать титр 1:1600.

В эксперименте на мышах был определён индекс ПС одного из концентратов иммуноглобулинов, полученных в лабораторном опыте фракционирования иммунной плазмы. Образец содержал 9,9 % белка и антитела к ПА B. anthracis в титре 1:3200, что эквивалентно титру 1:1600 5 % раствора. Индекс его ПС составил 0,4. Таким образом, проведённое исследование продемонстрировало наличие принципиальной возможности получения эффективного противосибиреязвенного ВВИГ.

Опыт разработки ВВИГ различной специфичности свидетельствует, что целевые антитела в процессе производства концентрируются не менее чем в раза [Шарыгин С.Л., 1997, Мальцева О.В., 2002]. Следовательно, минимальным уровнем антител к ПА в иммунной плазме, содержание белка в которой также примерно равно 5 %, следует считать титр 1:400.

Определение биохимических параметров экспериментальных серий противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека Из иммунной плазмы с применением 3 различных технологических приёмов получено 5 экспериментальных серий противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека. Их основные параметры представлены в табл. 2.

Таблица Основные параметры противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека Параметр Серия № 1 Серия № 2 Серия № 3 Серия № 4 Серия № Концентрация 5,3 5,4 4,5 6,9 7,белка, % Содержание антител к ПА 1:1600 1:1600 1:3200 1:1600 1:B. anthracis в титре Фракционный Интенсивная дуга состав в ИЭФ преципитации IgG с IgG, IgA - - расщеплением Фракционный состав в ЭФ, %:

2,5 8,- 2-глобулины; 0 0 24,8 24,- -глобулины; 0 0 72,7 67,100 100 - -глобулины.

Молекулярные параметры, %:

- полимеры; 0,0 0,0 0,- - - димеры; 5,8 3,3 4,- мономеры; 79,7 84,9 94,- фрагменты. 14,5 11,8 0,АКА 2 СН1 мг белка 1 мг белка сохраняют потребляет потребляет активность в - - 0 СН50 0 СН50 присутствии 10 мг белка Содержание имму- ноглобулинов, мг/мл:

- IgG; - - - 31,3 10,- IgM; 8,8 18,- IgA. 7,5 6,Препараты серий № 1, № 2 и № 3 представляют собой бесцветные, прозрачные, стерильные, апирогенные, нетоксичные растворы со сниженной АКА, свободные от маркёров основных гемотрансмиссивных инфекций.

Белковых примесей по результатам ИЭФ (рис. 1) и ЭФ не выявлено, полимеры не обнаружены (рис. 2). Таким образом, параметры серий № 1, № 2 и № удовлетворяют требованиям, предъявляемым к ВВИГ. Специфическая активность препаратов достигла эффективного уровня.

Рисунок 1. Иммуноэлектрофореграмма иммуноглобулинового препарата серии № Примечание.

Катод слева, анод справа.

В траншеях антисыворотка кролика к белкам сыворотки крови человека.

В лунках:

1 – сыворотка крови человека;

2 – иммуноглобулиновый препарат серии № 1.

2,1,0,0 100 200 300 400 Объем элюата, мл Рисунок 2. Хроматограмма иммуноглобулинового препарата серии № Препараты серий № 4 и № 5 представляют собой стерильные растворы, свободные от маркёров основных гемотрансмиссивных инфекций. Соотношение Оптическая плотность иммуноглобулинов трёх основных классов (IgG : IgM : IgA) примерно равно 4 : 1 : 1 в серии № 4 и 1,5 : 3 : 1 в серии № 5. Основные параметры препаратов удовлетворяют требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для энтерального применения.

Хранение образцов ВВИГ более 30 месяцев при температуре от 2 до 6 C не вызвало снижения специфической активности, что свидетельствует о высокой стабильности антител к ПА. В процессе лиофилизации внутривенного иммуноглобулина содержание целевых антител изменений также не претерпело.

Это указывает на наличие принципиальной возможности получения препарата в сухой лекарственной форме.

Определение условий заготовки и хранения иммунного сырья Комбинированная вакцина была выбрана для иммунизации доноров как наиболее иммуногенная и наименее реактогенная из всех типов вакцин, выпускаемых в настоящее время. Доноры по мере прохождения медицинского осмотра были разделены на две группы численностью 38 и 23 человека. В первой группе применяли сухую форму вакцины, во второй – жидкую. Срок наблюдения составил 20 недель. Целевые антитела не выявлены у 8 доноров (13 %). В крови ещё 11 иммунизированных лиц (18 %) антитела к ПА зарегистрированы на уровне, не достаточном для получения иммунной плазмы. Характеристика специфической активности сыворотки крови доноров, ответивших целевой антителопродукцией, представлена в табл. 3.

Суммарная продолжительность и средний срок первой регистрации антител к ПА B. anthracis в титре 1:400 или выше были сопоставимы в обеих группах. На основании расчёта критерия z различие относительного количества доноров с достаточным содержанием целевых антител в крови является статистически незначимым (p = 0,446). Различия в гуморальном иммунном ответе лиц разного пола на основании расчёта критерия 2 также статистически незначимы (p = 0,497). Продолжительность циркуляции антител к ПА в крови и доля иммунологически активных доноров достаточны для организации заготовки иммунного сырья. Таким образом, с целью получения плазмы для изготовления противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека рационально иммунизировать доноров любой формой комбинированной сибиреязвенной вакцины, а первую явку для исследования специфической активности крови назначать через 5 недель после вакцинации.

Таблица Характеристика специфической активности сыворотки крови доноров, ответивших целевой антителопродукцией на вакцинацию комбинированной сибиреязвенной вакциной Сухая форма Жидкая форма Показатель вакцины вакцины Первая регистрация антител к ПА в титре 5 1:400, недели после вакцинации Суммарная продолжительность регистрации 10 титра 1:400 или более высокого, недели Относительное количество доноров, содержание антител к ПА в крови которых 74 достигло титра 1:400, % Восемь доноров первой группы через 13 - 14 месяцев после первичной иммунизации были ревакцинированы. Уже через неделю целевые антитела были зарегистрированы в титре 1:800. Динамику специфической активности крови можно описать как постепенное снижение титров. Суммарная продолжительность циркуляции антител на достаточном уровне составила 35 недель. Следовательно, ревакцинация доноров позволяет значительно расширить сырьевую базу для получения противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов.

С целью определения стабильности антител к ПА в процессе хранения плазмы образцы сыворотки иммунизированных доноров со значимой специфической активностью замораживали и выдерживали при температуре не выше минус 30 °С. По истечении 6, 9, 12 или 20 месяцев сыворотку размораживали и определяли в ней содержание целевых антител. Всего исследовано 28 образцов, из них 21 с исходным титром 1:800 и 7 с исходным титром 1:400. Через 6, 9 и 12 месяцев среднее содержание целевых антител сохранялось на исходном уровне. Снижение специфической активности зарегистрировано через 20 месяцев хранения сыворотки, причём во всех случаях падение титров было равно одному шагу разведения в ИФА. Путём расчёта парного критерия Стьюдента уменьшение содержания антител к ПА через месяцев признано статистически значимым (p = 0,016 для исходного титра 1:800 и p = 0,000 для исходного титра 1:400). Следовательно, срок хранения иммунного сырья не должен превышать 1 год после заготовки при температуре не выше минус 30 °С.

Изучение биологических свойств противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека Методом иммуноблоттинга в препаратах всех серий выявлены антитела к ПА, а также к его третьему и четвёртому доменам (рис. 3). В ИФА дополнительно показано наличие антител к летальному фактору B. anthracis.

1 2 3 - 170 кД - 130 кД - 95 кД - 72 кД - 55 кД - 43 кД - 34 кД - 26 кД Рисунок 3. Иммуноблот противосибиреязвенного иммуноглобулинового препарата человека Примечание.

Дорожки:

1 – ПА;

2 – третий домен ПА;

3 – четвёртый домен ПА;

4 – маркёры молекулярной массы. Справа указаны величины молекулярных масс маркерных белков.

Токсиннейтрализующей активностью in vitro также обладали все экспериментальные образцы препаратов (рис. 4). В разведении 1:5 серии № 1, № и № 4 нейтрализовали летальный токсин практически полностью, а серии № 3 и № 5 - примерно на 140 %. Данный феномен можно объяснить активацией или ингибированием клеточных процессов по Fc-рецепторному механизму.

Связываясь с рецепторами типа FcRII, специфичными к иммунным комплексам, кластер молекул «антиген – антитело» мог интенсифицировать, например, синтез и экскрецию цитокинов или, напротив, блокировать реакции апоптоза, повышая тем самым процент выживших клеток. Серии № 1, № 2 и № 4 аналогичного влияния не оказывали, видимо, вследствие частичного нарушения эффекторных функций молекул IgG.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»