WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ДОЛМАТОВ Владимир Юрьевич ПОЛУЧЕНИЕ ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ЧЕЛОВЕКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 03.00.23 – биотехнология 14.00.29 – гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Киров - 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор С.Л. Шарыгин доктор биологических наук А.Г. Лютов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Н. Мигунов доктор медицинских наук, профессор А.В. Степанов

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека»

Защита диссертации состоится «_» 2008 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 Федерального государственного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека» (125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» Автореферат разослан «» 2008 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук С.Ю. Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Сибирская язва – тяжёлое инфекционное заболевание, внимание к которому и в России, и во всем мире в последнее время значительно возросло, что связано, в первую очередь, с угрозой биотерроризма, уже нашедшей практическое воплощение на территории США [Jernigan J.A. et al., 2001, Pittman P.P. et al., 2005]. Споры возбудителя сибирской язвы – Bacillus anthracis - с точки зрения большинства представителей военных ведомств и антитеррористических организаций, на сегодняшний день представляют собой наиболее опасное самостоятельное биологическое оружие [Рубинштейн Э., 2001]. Кроме того, остаётся высокой вероятность возникновения эпидемий инфекции в результате активизации широко распространённых почвенных резервуаров сибиреязвенного микроба [Пименов Е.В. с соавт., 2000].

Основным средством лечения сибирской язвы у людей в настоящее время являются антибактериальные препараты [Онищенко Г.Г. с соавт., 1999]. Однако даже при использовании антибиотиков последнего поколения, передовых методов диагностики и высокотехнологичного оборудования смертность при лёгочной форме инфекции достигает 45 % [Spencer R.C., 2003]. Проведение интенсивной химиотерапии может вызывать ряд неблагоприятных побочных эффектов вплоть до летального исхода вследствие масштабного высвобождения токсина при разрушении клеток возбудителя [Hanna P., 1999, Collier R.J. et al., 2003].

Единственный производимый в настоящее время антитоксический препарат – «Глобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий» - предназначен для внутримышечного введения, поэтому его применение не позволяет достичь быстрого нарастания антител в крови реципиента до защитного уровня.

Современная научная разработка, направленная на ферментативное расщепление молекул иммуноглобулина, содержащихся в препарате, и выделение иммунохимически чистых (Fab)2-фрагментов, может привести к созданию антитоксического лекарственного средства, пригодного для внутривенного введения [Маринин Л.И. и соавт., 1999]. Однако любые гетерогенные сывороточные препараты обладают сенсибилизирующими свойствами и способны вызывать у людей анафилактические реакции [Шарыгин С.Л., 1997].

Мировой опыт разработки и применения специфичных внутривенных иммуноглобулинов человека (ВВИГ) свидетельствует об их высокой эффективности и ареактогенности при лечении тяжёлых инфекционных заболеваний различной этиологии [Сапожникова В.С., 1990, Мальцева О.В., 2002, Шкуратова О.В., 2002, Arnon S.S. et al., 2006], поэтому актуальность создания аллогенного антитоксического противосибиреязвенного иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения, не вызывает сомнений. Основой нового препарата могут стать антитела к протективному антигену (ПА) B. anthracis – единственной антигенной детерминанте сибиреязвенного микроба, иммуногенные свойства которой однозначно доказаны [Cote C.K. et al., 2003].

Определённый интерес представляет также разработка комплексного препарата для энтерального применения, содержащего иммуноглобулины трёх основных классов с антительной активностью в отношении ПА.

Цель исследования - получение экспериментальных образцов противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов из плазмы крови человека и изучение их биологических свойств.

Задачи исследования 1. Оценить возможность выделения антител человека к протективному антигену B. anthracis из донорской плазмы, определить минимальную специфическую активность иммунного сырья, достаточную для получения противосибиреязвенных препаратов.

2. Изучить динамику гуморального ответа доноров на иммунизацию комбинированной сибиреязвенной вакциной и ревакцинацию живой вакциной, установить возможный период заготовки и условия хранения иммунной плазмы.

3. Получить из иммунной плазмы по трём различным технологическим схемам концентраты иммуноглобулинов, пригодные для внутривенного и энтерального применения, и определить их биохимические параметры.

4. Изучить спектр антител к различным антигенным детерминантам сибиреязвенного токсина и оценить токсиннейтрализующую активность полученных экспериментальных образцов препаратов in vitro.

5. Определить профилактическую и лечебную эффективность внутривенного иммуноглобулина в эксперименте на животных.

Основные этапы работы выполнены в рамках договора № 10-д-2002 от 01.07.02 г. между ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий» (КНИИГиПК) и ФГУ «48 Центральный НИИ Минобороны России» (ЦНИИ МО) о совместном научном исследовании «Разработка технологий и создание аппаратурно-технических линий по производству препаратов против сибирской язвы», а также в рамках научно-исследовательской работы КНИИГиПК по созданию специфичных иммуноглобулинов человека для внутривенного введения (номер государственной регистрации комплексной темы 01200604343).

Научная новизна Впервые показана возможность получения аллогенного противосибиреязвенного иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения, из плазмы иммунизированных доноров. По материалам исследования подана заявка на патент Российской Федерации «Иммуноглобулин человека противосибиреязвенный для внутривенного введения» № 2006129089/20/03/608, приоритет от 10.08.06 г.

Установлен минимальный уровень антител к протективному антигену B. anthracis в сырье для получения препарата. Охарактеризована динамика содержания антител в крови доноров, иммунизированных сибиреязвенными вакцинами. Оценена стабильность специфической активности плазмы при хранении.

Показано, что экспериментальные образцы иммуноглобулинов содержат антитела к различным антигенным детерминантам сибиреязвенного токсина. В опыте на культуре клеток определена токсиннейтрализующая активность препаратов.

Доказана профилактическая и лечебная эффективность внутривенного иммуноглобулина в эксперименте.

Практическая значимость работы Определены требования к иммунному сырью и условия его хранения.

Показана возможность использования трёх технологических схем выделения антител из донорской плазмы для получения противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов для внутривенного и энтерального применения.

Внедрение результатов исследования в практику Отработана технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения с применением метода инкубации в кислой среде, утверждён производственный регламент ПР-18756307-02-06.

Укомплектована технологическая линия производства специфичных внутривенных иммуноглобулинов человека в отделе препаратов крови ФГУ «КНИИГиПК Росмедтехнологий».

Проведено аппаратурное оснащение экспериментально-производственной лаборатории фракционирования плазмы ЗАО «Иммуно-Гем», сформирована линия по выпуску «Иммуноглобулинового комплексного препарата» (ПР-18756307-03-06) и налажено его промышленное производство.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Однократная вакцинация доноров комбинированной сибиреязвенной вакциной обеспечивает образование антител к протективному антигену B. anthracis в титре не менее 1:400 у 69 % людей. Заготовку иммунной плазмы целесообразно начинать с пятой недели после иммунизации.

2. Технология этанольного фракционирования донорской плазмы с последующим пепсинолизом полупродукта или его инкубацией в кислой среде позволяет получать иммуноглобулиновые препараты, пригодные для внутривенного введения и содержащие антитела к третьему, четвёртому доменам протективного антигена, а также к летальному фактору сибиреязвенного микроба.

3. Образцы внутривенного иммуноглобулина при профилактическом и лечебном применении в эксперименте обладают защитным эффектом, сравнимым с действием гипериммунного лошадиного противосибиреязвенного препарата.

Апробация работы Диссертация апробирована на расширенной научно-лабораторной конференции ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий» 22.05.08 г.

Основные результаты работы доложены на научной конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (г. Киров, 2005 г.), научно-практической конференции молодых учёных «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (г. Киров, 2007 г.), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.) и Всероссийском совещании «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения)» (г. Киров, 2008 г.).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Объём и структура диссертации Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трёх глав с изложением результатов собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 119 источников, из них 75 отечественных и 44 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 21 таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Иммунизация доноров коммерческими сибиреязвенными вакцинами разрешена Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (письмо № 81-07/47 от 12.03.01 г.). Кадровым донорам станции переливания крови КНИИГиПК, давшим письменное информированное согласие на вакцинацию и прошедшим медицинский осмотр, вводили «Вакцину сибиреязвенную комбинированную сухую и жидкую для подкожного применения» серии 1/02 или 5/02 производства ЦНИИ МО. Всего иммунизирован 61 донор. При ревакцинации использовали «Вакцину сибиреязвенную живую сухую для подкожного и скарификационного применения» серии производства ЦНИИ МО. Всего было ревакцинировано 8 доноров. Вакцины вводили однократно подкожно в объёме 0,5 мл.

Содержание антител в сыворотке крови людей, а также в технологических белковых растворах, концентратах иммуноглобулинов и в иммуноглобулиновых препаратах определяли методом непрямого гетерогенного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением «Тест-системы иммуноферментной для определения титров антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба в сыворотке крови человека», разработанной сотрудниками ЦНИИ МО. Доноров допускали к плазмодаче на основании приказа Минздрава РФ № 364 от 14.09.01 г.

Плазму заготавливали методом плазмафереза. Хранение плазмы осуществляли в соответствии с приказами Минздрава РФ № 193 от 07.05.03 г. и Минздравсоцразвития РФ № 147 от 21.02.05 г.

В лабораторном опыте фракционировали 9 порций иммунной плазмы общим объёмом 2745 мл по технологии, описанной в «Типовом комплексном регламенте производства белковых препаратов плазмы донорской крови» (утв. зам. министра здравоохранения ССР 21.12.79 г.). Фракцию В растворяли в 0,9 % водном растворе хлорида натрия, диализовали и стерилизовали фильтрацией. В результате эксперимента получено 40 мл концентратов иммуноглобулинов.

Экспериментально-производственные серии ВВИГ получены из 172 л иммунной плазмы: 2 серии общим объёмом 1,7 л по технологии пепсинолиза [Сапожникова В.С., Шарыгин С.Л., 1996 г.] (серии № 1 и № 2) и одна серия объёмом 1,8 л по технологии инкубации в кислой среде [Алёшкин В.А., Лютов А.Г., 1998 г.] (серия № 3). Из 400 г фракции Б, выделенной при производстве серий № 1 и № 2, получены две экспериментальные серии комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) общим объёмом 250 мл по технологии извлечения иммуноглобулинов из фракции Б [Алёшкин В.А. и соавт., 1997 г.] (серии № 4 и № 5). Пять образцов препарата серии № 3 лиофилизировали.

Физико-химические, химические, биохимические, иммунохимические и биологические параметры концентратов иммуноглобулинов и иммуноглобулиновых препаратов определяли, в основном, в соответствии с МУК 4.1/4.2.588-96. Концентрацию мальтозы устанавливали по методике, описанной в Государственной фармакопее (ГФ XI). Анализ молекулярных параметров проводили методом эксклюзионной колоночной хроматографии с использованием сефакрила S-300. Антикомплементарную активность (АКА) серий № 1 и № 2 определяли в соответствии с МУК 3.3.2.1063-01, серии № 3 – по ФСП 42-0194488403. Содержание IgG, IgA, IgM оценивали методом радиальной иммунодиффузии в геле. Контроль на наличие НBsAg, антител к ВИЧ, вирусу гепатита С и возбудителю сифилиса проводили методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем.

С целью изучения спектра антител в иммуноблоттинге осуществляли электрофорез антигенных детерминант, полученных сотрудниками ФГУН «Государственный научный центр прикладной биотехнологии и микробиологии» (ГНЦ ПМБ), в 10 % полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. После электрофореза разделённые фракции переносили на нитроцеллюлозную мембрану «Hybond-ECL» («Amersham», США). Антитела визуализировали с помощью пероксидазы и диаминобензидина.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»