WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Рис. 32. Белковый состав экстракта, полученного при обработке BBM An. stephensi додецилсульфатом натрия. На 10% полиакриламидный гель нанесен экстракт (1), в лунку (2) помещены стандарты молекулярной массы. Рис. 33. Идентификация токсинсвязывающего белка из BBM An. stephensi с помощью лиганд-блоттинга. Белки, экстрагированные из BBM An. stephensi, были подвергнуты электрофорезу в денатурирующих условиях и электропереносу. Полученные нитроцеллюлозные реплики инкубировали с биотинилированными белками: (а) Cry4B-tox; (б) Cry11A; (в) бычий сывороточный альбумин.

Рецепторы токсинов, выделенные из различных видов насекомых, как правило, не связываются с Cry-белками, к которым данное насекомое устойчиво. Поэтому изучение специфичности связывания является важным этапом в доказательстве участия данного токсинсвязывающего белка в выполнении рецепторной функции in vivo.

Рис. 34. Электрофоретический анализ фракций, полученных в ходе аффинной хроматографии белков BBM An. stephensi.

Электрофорезу подвергли следующие образцы: экстракт мембранных белков (дорожка 2); белки, не связавшиеся с Cry4B-сефарозой (дорожка 3); фракции, элюированные 1 М NaCl с Cry11A- сефарозы (дорожка 4) или с Cry4В- сефарозы (дорожка 5). Дорожка 1 содержит стандарты молекулярной массы. Гели проявляли с помощью Кумасси R-250 (а), или методом лиганд-блоттинга с использованием в качестве лиганда биотинилированного эндотоксина Cry11A (б).

В условиях лиганд-блоттинга белки, элюируемые как с Cry11А-, так и с Cry4Всефарозы, одинаково реагируют и с Cry4B-tox и с эндотоксином Cry11А (рис. 35, 36). В то же время, они практически не взаимодействуют с биотинилированными Cry1A-tox, обладающими лепидоцидной активностью, и Cry3А, действующим на личинок жуков, используемыми в два раза большей концентрации (в случае Cry3А это иллюстрируется рис. 35).

Эндотоксин Cyt1A также не обладает способностью связываться с 65 и 57 кДа белками из An. stephensi. Этому токсину свойственна высокая москитоцидная активность, однако известно, что при осуществлении своего токсического эффекта он не нуждается во взаимодействии с рецептором. Все эти результаты доказывают высокую специфичность, проявляемую 65 и 57 кДа белками из An. stephensi при взаимодействии с токсинами В. thuringiensis.

С помощью лиганд-блоттинга мы изучили некоторые особенности взаимодействия москитоцидных токсинов: Cry4B-tox и Cry11А с выделенными мембранными белками. В частности, если нитроцеллюлозные реплики, содержащие белки, элюируемые с Cry11А- или с Cry4B-сефарозы, проинкубировать с биотинилированным Cry4B-tox, а затем с избытком небиотинилированного варианта этого же токсина, то используемая система детекции не выявляет полос, соответствующих 65 и 57 кДа белкам. Это говорит об обратимости связывания Cry4B-tox с изучаемыми мембранными белками.

Рис. 35. Связывание 65 и 57 кДа белков из BBM An. stephensi с различными эндотоксинами B. thuringiensis и продуктами их ограниченного протеолиза. Нитроцеллюлозные реплики, содержавшие 65 и 57 кДа белки, элюированные с Cry4B-сефарозы, инкубировали со следующими биотинилированными белками: Cry4B-tox (а); Cry3A (б); Cry4B-tr (в); Cry4B-Аa (г); Cry11A (д); Cry11A-tr (е).

Рис. 36 - Гомологическая и гетерологическая конкуренция и обратимость, выявляемые при изучении связывания Cry4B-tox с 65 и 57 кДа белками из BBM An. stephensi. Нитроцеллюлозные реплики, содержавшие 65 и 57 кДа белки, элюированные с Cry4B- сефарозы (1) и с Cry11А- сефарозы (2), инкубировали со следующими эндотоксинами или их смесями: (а) биотинилированным Cry4B-tox (4 мкг/мл); (б) смесью биотинилированного Cry4B-tox (4 мкг/мл) и небиотинилированного Cry4B-tox (40 мкг/мл); (в) смесью биотинилированного Cry4B-tox (4 мкг/мл) и небиотинилированного Cry11А (40 мкг/мл). В случае (г) после обработки нитроцеллюлозного фильтра биотинилированным Cry4B-tox (мкг/мл) следовала его инкубация с десятикратным избытком небиотинилированного варианта этого же токсина.

Полосы 65 и 57 кДа не проявляются в условиях гомологической конкуренции, когда нитроцеллюлозные реплики инкубировали со смесью биотинилированного Cry11A или Cry4B-tox и 10-кратного избытка небиотинилированного варианта соответствующего токсина (для Cry4B-tox это иллюстрируется на рис. 36). Полученные результаты говорят о том, что способность к связыванию с 65 и 57 кДа-белками не является следствием биотинилирования москитоцидных токсинов.

В условиях гетерологической конкуренции, когда реплики обрабатывают смесью биотинилированного Cry4B-tox или Cry11A и 10-кратного избытка небиотинилированного гетерологического белка (Cry 11A или Cry4B-tox, соответственно) проявления полос также не наблюдается (для первого варианта показано на рис. 36). Это со всей очевидностью показывает, что Cry11А и Cry4B-tox взаимодействуют с одними и теми же белками в мембранах этого насекомого. Более того, они либо связываются с одними и теми же сайтами на поверхности этих белков, либо сайты связывания расположены близко друг к другу.

Ранее было показано, что ход ограниченного протеолиза эндотоксина Cry4B зависит от специфичности используемого протеолитического фермента. Под действием хи мотрипсина образуется активированный токсин с молекулярной массой 64 кДа (Cry4Btox), с которым проводились вышеописанные эксперименты по связыванию. Однако при обработке рядом других протеолитических ферментов активированный токсин гидролизуется до фрагмента с молекулярной массой 50 кДа (обработка трипсином) (Cry4B-tr), или до смеси 48 и 49 кДа-фрагментов (обработка кишечным соком Ae. aegypti) (Cry4B-Aa). В первом случае от него отщепляются пять -спиралей N-концевого домена, тогда как во втором случае дополнительно к этому небольшую деградацию претерпевает С-конец третьего домена. По данным лиганд-блоттинга Cry4B-tr взаимодействует с 65 и 57 кДа белками столь же хорошо, как и Cry4B-tox (рис. 35). В то же время Cry4B-Аa не обладает способностью связываться с 65 и 57 кДа белками (рис. 35). Это коррелирует с литературными данными по биологической активности, согласно которым Cry4B-tr обладает такой же токсичностью для личинок комаров, как и Cry4B-tox, но Cry4B-Aa практически не токсичен. Можно предположить, что резкое уменьшение токсичности в последнем случае связано с потерей способности соответствующих фрагментов связываться с рецепторами.

В свою очередь, ограниченный протеолиз эндотоксина Cry11А до двух фрагментов с молекулярной массой 33 и 36 кДа не уменьшает его токсичность по отношению к личинкам Ae. aegypti, An. stephensi и Culex pipiens (литературные данные) и не отражается на способности к связыванию с мембранными белками An. stephensi (рис. 35). Фракция, элюированная с колонки Cry4В-сефароза 1 M NaCl, была сконцентрирована в 200 раз и нанесена на 10%-ный ПААГ. Из нитроцеллюлозной реплики, полученной в ходе последующего электрофореза и электропереноса, были вырезаны полосы, соответствующие белкам с молекулярной массой 65 и 57 кДа и белковый материал, содержащийся в этих полосах, проанализирован автоматическим методом Эдмана.

Для компонента с молекулярной массой 65 кДа прочитать N-концевую последовательность не удалось. По всей видимости, концевая аминогруппа этого белка была модифицирована. Но для компонента с молекулярной массой 57 кДа была получена следующая последовательность : Ser-Leu-His-Gln-His-Ile-Phe-Ser-Asp-Leu.

Эта последовательность уникальна. Поиск её среди белковых последовательностей, содержащихся в NCBI GenBank, дал отрицательные результаты. В настоящее время установлен и опубликован полный геном Anopheles gambiae – вида, родственного An.

stephensi. В составе соответствующего протеома мы также не нашли белковой последовательности, полностью совпадающей с последовательностью, установленной нами, однако там имеется рамка считывания, кодирующая первые шесть остатков прочитанного декапептида (Ser-Leu-His-Gln-His-Ile), но функции этого белка неизвестны.

Ранее в литературе было высказано предположение о возможной роли щелочной фосфатазы в связывании токсина Cry1Ac с кишечником гусеницы Heliothis virescens. Мы исследовали возможность наличия фосфатазной активности у выделенных нами 65 и кДа белков. В условиях дот-анализа в экстракте мембранных белков из кишечника личинок An. stephensi выявляется высокая активность щелочной фосфатазы. Концентрат фракции, элюированной 1 M NaCl с колонки содержащей Cry11А-сефарозу, также демонстрирует активность щелочной фосфатазы. Интенсивность выявляемого сигнала не высока, но достоверна. Использованный в качестве отрицательного контроля бычий сывороточный альбумин в концентрации 0,2 мг/мл в условиях дот-анализа никакого образования окраски не демонстрирует. В геноме An. gambiae имеются гены нескольких белков, предположительно обладающих активностью щелочной фосфатазы. Нам не удалось обнаружить какого-либо сходства между N-концевым фрагментом 57 кДа-белка и этими последовательностям. Однако активность щелочной фосфатазы может быть связана с 65 кДа-белком, Nконцевую последовательность которого установить не удалось.

Сравнение полученных нами данных о токсинсвязывающих белках An. stephensi со свойствами ранее выделенных в нашей лаборатории токсинсвязывающих белков Ae. aegypti показывает их близость по большинству параметров. Это позволяет предположить, что выявленные нами токсинсвязывающие белки из двух видов комаров, An. stephensi и Ae. aegypti, родственны, хотя, возможно, и не идентичны и представляют собой новый класс (классы) рецепторов энтомоцидных белков.

Заключение В данной работе мы провели комплексное изучение воздействия москитоцидных токсинов Cry4B и Cry11A, продуцируемых B. thuringiensis ssp. israelensis, на кишечный эпителий личинок комаров. Гистологические исследования продемонстрировали серьёзные изменения, происходящие под действием москитоцидных белков в эпителиальных клетках и перитрофической оболочке личинок комаров в средней кишке. Эти изменения включают деградацию микроворсинок, вакуолизацию цитоплазмы и разрушение клеточных органелл, и, в общем, близки тем, что показаны для гусениц, обработанных лепидоцидными токсинами В. thuringiensis. Гистохимические эксперименты показали, что, как и в случае лепидоцидных токсинов, эндотоксин Cry11A и Сry4B-tox связываются с микроворсинками кишечного эпителия средней кишки чувствительного насекомого. Используя метод аффинной хроматографии на синтезированных нами сорбентах Cry11A- и Сry4Bсефароза, мы выделили белки с молекулярной массой 65 и 57 кДа, способные обратимо и специфично связывать указанные токсины. По всем изученным характеристикам эти бел ки близки 65 и 62 кДа токсинсвязывающим белкам, выделенным ранее в нашей лаборатории из апикальных мембран кишечного эпителия личинок Ae. aegypti. В то же время, по молекулярной массе и энзиматической активности, указанные токсинсвязывающие белки существенно отличаются от белков, выполняющих аналогичную функцию у гусениц (аминопептидазы N и кадгериноподобные белки). Тот факт, что связывание москитоцидных и лепидоцидных токсинов В. thuringiensis с разными рецепторными белками приводит к однотипным гистопатологическим изменениям эпителия у личинок комаров и у гусениц чешуекрылых, обусловлено особенностями Cry-белков. Общая принципиальная схема организации вторичной и третичной структуры белков сочетается у них с существенными различиями первичной структуры в тех районах молекулы, которые ответственны за связывание с рецептором или внутримолекулярные перестройки. Именно такая стратегия позволяет токсинам В. thuringiensis приспособиться к физиологическим и биохимическим особенностям, характерным для различных видов насекомых.

ВЫВОДЫ 1. С помощью электронной микроскопии показано, что под действием москитоцидных белков Bacillus thuringiensis ssp. israelensis в средней кишке личинок комара Aedes aegypti происходят ультраструктурные изменения клеток столбчатого эпителия, включающие дезинтеграцию цитоплазмы, образование удлинённых лакун, деградацию клеточных органелл и разрушение микроворсинок. Перитрофическая оболочка смещается в полость средней кишки. В ультраструктуре клеток эпителия передней и задней кишки какихлибо изменений не отмечено.

2. Сравнение влияния энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных токсинов Cry4B и Cry11A показывает, что эффект всех трёх препаратов однотипен, хотя наиболее сильные разрушения происходят под действием кристаллов.

3. С помощью цитохимических методов установлено, что специфическое связывание эндотоксина Cry11A и активированного токсина Cry4B (Cry4B-tox) с тканями личинок комара Aedes aegypti происходит только в области микроворсинок эпителия средней кишки и перитрофической оболочки.

4. Из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара Anopheles stephensi методом аффинной хроматографии выделены белки с молекулярной массой 65 и кДа, способные специфически связываться с эндотоксином Сry11A и Cry4B-tox в условиях лиганд-блоттинга, причём оба Cry-белка конкурируют друг с другом за это связывание.

5. Способность продуктов ограниченного протеолиза эндотоксинов Сry11A и Cry4B к связыванию с 65 и 57 кДа белками коррелирует с их активностью для личинок комаров. N-концевая аминокислотная последовательность 57 кДа белка уникальна и отсутствует в NCBI GenBank.

6. По большинству изученных свойств 65 и 57 кДа белки сходны с токсинсвязывающими белками Aedes aegypti и, возможно, образуют вместе с ними новый класс (классы) рецепторов дельта-эндотоксинов.

Список публикаций по теме диссертации Дронина М.А., Чайка С.Ю., Ревина Л.П., Костина Л.И., Залунин И.А., Честухина Г.Г.

Визуализация связывания эндотоксинов Cry4B и Cry11A Bacillus thuringiensis с кишечным эпителием личинок Aedes aegypti // Биотехнология. 2002. № 3. С. 8084.

Залунин И.А., Чайка С.Ю., Дронина М.А., Ревина Л.П. Цитопатологическое влияние эндотоксинов Bacillus thuringiensis на кишечник личинок комаров Aedes aegypti // Паразитология. 2002. Т. 36. Вып. 5. С. 337-344.

Дронина М.А., Ревина Л.П., Костина Л.И., Ганушкина Л.А., Залунин И.А., Честухина Г.Г. Токсинсвязывающие белки из мембран кишечного эпителия личинок Anopheles stephensi // Биохимия. 2006. Т. 71. Вып. 2. С. 173-181.

Чайка С.Ю., Залунин И.А., Дронина М.А. Влияние кристаллов эндотоксина Bacillus thuringiensis var. israelensis на ультраструктуру кишечника личинок комаров Aedes aegypti // ХХVII Межвузовская научно-практическая конференция по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященная памяти акад. Е.Н.

Павловского / Материалы конференции. С.-Пб., 2000. С. 24-25.

Чайка С.Ю., Залунин И.А., Дронина М.А. Цитопатологическое влияние кристаллов эндотоксина Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечник личинок комаров Aedes aegypti // Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России. Великий Новгород, 2000. С. 29-33.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»