WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

2.10. Изучение обратимости связывания москитоцидных белков. Нитроцеллюлозные фильтры с содержавшимися на них 65 и 57 кДа белками инкубировали с биотинилированными Cry4B-tox (4 мкг/мл), как описано ранее, отмывали пятью сменами буфера инкубации, а затем обрабатывали в течение часа 10-кратныи избытком небиотинилированного варианта того же токсина 2.11. Определение N-концевой аминокислотной последовательности. 5 мл фракции, элюированной с помощью 1 M NaCl с сорбента Cry4B-сефароза, сконцентрировали в 200 раз посредством ультрафильтрации и осаждения трихлоруксусной кислотой и подвергли электрофорезу в присутствии додецилсульфата натрия и электропереносу на мембрану Immobilon-PSQ. N-концевую аминокислотную последовательность для полос, соответствующих 65 и 57 кДа белкам, определяли с помощью автоматического газофазного секвенатора «Applied Biosystems», США, модель 470А.

Поиск последовательностей, ортологичных установленным экспериментально, осуществляли с помощью программы BLAST Search for short, nearly exact matches, используя базу данных NCBI GenBank 2.12. Определение активности щелочной фосфатазы. По 2 мкл следующих препаратов: (а) экстракт белков ВВМ, полученный, как описано выше и разведённый в раз 0,05 М натрий-карбонатным буфером, рН 9,5; (б) фракция, элюированная 1 M NaCl с сорбента Cry4B-сефароза, сконцентрированная в 10 раз с помощью ультрафильтрации; (в) 0,02 %-ный БСА, были нанесены в виде дотов на нитроцеллюлозный фильтр. Фильтр тщательно отмыли вышеупомянутым буфером и инкубировали с субстратами фосфатазной реакции (NBT/BCIP, «Promega», США). При такой постановке эксперимента о наличии в образце активности щелочной фосфатазы должно свидетельствовать появление сиреневой окраски в соответствующем доте.

Глава 3. Влияние энтомоцидных кристаллов B. thuringiensis ssp.

israelensis, а также индивидуальных эндотоксинов Cry11A и Cry4B на кишечный эпителий личинок комаров Aedes aegypti Наиболее ранние изменения кишечного эпителия при воздействии кристаллов B.t.

ssp. israelensis происходят в апикальной части клеток. Если в контроле (рис. 1, 2) поверхность клеток покрыта микроворсинками, внутри которых обнаруживаются тонкие продольно ориентированные филаменты, а с наружным слоем клеточной мембраны связан гликокаликс, то уже через 20 мин инкубации микроворсинки утолщаются и укорачиваются, а целостность эпителиального слоя нарушается. При последующей инкубации эти процессы усугубляются: во многих местах можно наблюдать разрывы между соседними клетками (рис. 3), а также деградацию микроворсинок и утрату ими гликокаликса (рис. 3, 4).

Похожие изменения происходят при воздействии отдельных токсинов. Уже через минут инкубации с Cry11A в концентрации 100 нг/мл, микроворсинки укорачиваются и утолщаются, их мембрана лишается гликокаликса (рис. 5). При действии эндотоксина Cry4B микроворсинки также укорачиваются, и их размещение становится беспорядочным, а через 3 часа большая их часть достаточно сильно редуцирована (рис. 6, 7). В то же время, в отличие от действия кристаллов не наблюдается полной потери микроворсинок, а также разрывов между клетками.

В норме у личинок комаров вблизи от апикальной поверхности эпителиальных клеток расположена перитрофическая оболочка. Как видно на рисунке 8, она состоит из нескольких слоёв, различающихся электронной плотностью. При воздействии отдель- ных токсинов расстояние между перитрофической оболочкой и эпителием увеличивается, но её внутренняя структура практически остаётся без изменений (рис. 5, 6).

Однако при воздействии кристаллов электронная плотность перитрофической оболочки уменьшается, и её структура разрушается (рис. 9).

Нормальный вид цитоплазмы эпителиальных клеток и их органелл представлен на рисунках 10 и 11. При обработке кристаллами в цитоплазме клеток средней кишки наблюдаются следующие изменения: цитоплазма клеток достаточно быстро подвергается значительной дезинтеграции. В митохондриях происходит расширение крист, образуются пустоты (рис. 12). Меняется структура эндоплазматического ретикулума и лизосом (рис. 13). Сходные изменения происходят после инкубации личинок с отдельными белками. Среди митохондрий много вздутых, с разной степенью редукции крист: от незначительной до почти полной (рис. 14-16).

Рис. 1-25. Ультраструктурные изменения, происходящие в кишечном эпителии личинок комара Ae. aegypti под действием энтомоцидных кристаллов B. thuringiensis ssp.

israelensis и индивидуальных токсинов Cry4В и Cry11A. В подписи к каждому рисунку указаны действующий препарат, концентрация белка и время инкубации с ним. Рис.

1–7. Апикальный отдел столбчатой клетки эпителия. 1, 2 – норма; 3 – кристаллы, 1 нг/мл, 2,5 ч.; 4 – кристаллы, 0,2 нг/мл, 3 ч.; 5 – Cry11A, 100нг/мл, 15 мин.; 6 – Cry 4В, 10 нг/мл, 3ч.; 7 –Cry 4В, 10 нг/мл, 3 ч. Рис. 8, 9. Перитрофическая оболочка. 8- норма; 9- кристаллы, 3 нг/мл, 20 мин. Рис. 10-17. Цитоплазма околоядерной области клетки и клеточные органеллы. 10,11- норма; 12- кристаллы, 1 нг/мл, 2.5 ч; 13- кристаллы, 0,2 нг/мл, 3 ч.;

14- Cry11A, 25нг/мл, 3ч.; 15- Cry11A, 100нг/мл, 3ч.; 16- Cry 4В, 40 нг/мл, 3ч.; 17- Cry 4В, 40нг/мл, 15мин. Рис. 18- 25. Базальная область эпителия. 18,19- норма; 20- Cry11A, 100нг/мл, 3ч.; 21- Cry 4В, 40 нг/мл, 3ч. Рис. 22,23. Мышцы, окружающие среднюю кишку. 22- норма; 23- кристаллы, 0,2 нг/мл, 3 ч. Рис. 24,25. Регенерационные клетки. 24- кристаллы, 1 нг/мл, 2.5 ч.; 25- Cry 4В, 10нг/мл, 1ч. Увеличения: рис. 1, 10, 12, 14, 16 - x000; рис. 2- x60 000; рис. 3, 5, 15, 18, 21- x10 000; рис. 4, 13- x30 000; рис. 6, 17, 24, 25- x8000; рис. 7, 8- x100 000; рис. 9- x40 000; рис. 11, 19, 20, 23- x15 000; рис. 22- x25 000.

Обозначения: МВ – микроворсинки, ПО – перитрофическая оболочка, М – митохондрия, Л – лизосома, В – вакуоль, Я – ядро, БЛ – базальный лабиринт, МЦ – мышцы, Р – регенерационная клетка.

В околоядерной зоне обнаруживаются удлиненные крупные вакуоли (рис. 14). Образование достаточно крупных вакуолей можно наблюдать в клетках эпителия уже через 15 минут (рис. 17). В цитоплазме встречаются большие тела, похожие на сильно деградировавшие лизосомы.

Для базальной части эпителиальных клеток личинок комаров характерно наличие базального лабиринта, в цитоплазматических тяжах которого содержатся митохондрии (рис.

18, 19). При воздействии как кристаллов B.t. ssp. israelensis, так и индивидуальных токсинов, в этом районе клетки также можно видеть сильную вакуолизацию цитоплазмы и деградацию митохондрий, хотя базальный лабиринт сохраняет свое ячеистое строение (рис. 20, 21).

При воздействии кристаллов мышцы, окружающие среднюю кишку (в норме показаны на рис. 22), теряют свою правильную структуру, в мышечных тканях появляются разрывы (рис. 23). Регенерационные клетки, расположенные в основании эпителиального пласта средней кишки, после обработки кристаллами отслаиваются от соседних клеток и сжимаются (рис. 24). После инкубации с отдельными белками, регенерационные клетки сохраняют нормальный вид и строение (рис. 25).

Подводя итог, можно сказать, что действие индивидуальных токсинов сходно с действием кристаллов по своим проявлениям, а также тем, что они оказывают значительный эффект уже в первые минуты экспозиции. Но при длительной экспозиции, в отличие от кристаллов, отдельные токсины не вызывают таких глубоких патологических изменений, какие наблюдаются при действии кристаллов за сходный период времени. Возможно, это связано как с синергическим эффектом действия токсинов, так и с тем, что в составе кристаллов присутствует ещё и белок Cyt1A, в данном исследовании не изучавшийся.

Следует заметить, что, поскольку используемые концентрации сравниваемых препаратов близки по уровню своей биологической активности, уровень патологических изменений, вызываемых отдельными токсинами, достаточен для гибели насекомых.

Глава 4. Гистохимическое изучение связывания эндотоксина Cry11A и активированного токсина Cry4B с эпителиальными клетками средней кишки личинок комара Aedes aegypti Как было показано выше, одной из основных мишеней москитоцидных белков Cry4B и Cry11A являются микроворсинки столбчатого эпителия средней кишки личинок комаров. Мы попытались доказать, что эти токсины связываются с апикальной мембраной кишечного эпителия насекомого. Одним из способов выявления структур пищеварительного тракта насекомого, обладающих аффинностью по отношению к токсинам, является инкубация гистологических срезов кишечника с этими белками и визуализация связавшегося токсина с помощью гистохимических и иммуногистохимических реакций. При этом эндотоксин Сry4B (130 кДа), являющийся протоксином, предварительно подвергали протеолизу с образованием активированного токсина (Cry4B-tox) (65 кДа). В экспериментах, описанных в предыдущей главе, этого делать не требовалось, поскольку аналогичная активация происходит в кишечнике личинки. Эндотоксин Cry11A (70 кДа) в активации не нуждается.

В результате проведенных экспериментов мы показали, что эндотоксин Cry11A и активированный токсин Cry4B (Cry4B-tox) связываются с апикальной мембраной столбчатых клеток кишечного эпителия (рис. 26, 28, 29, 30). Причём это связывание визуализировалось в ходе как гистохимической (рис. 26), так и иммуногистохимической (рис. 28, 29, 30) реакций. Под большим увеличением хорошо видно (рис. 29), что токсины откладываются по всей длине микроворсинок. Окраска щеточной каймы клеток при изучении обоих москитоцидных белков была очень интенсивной.

Для доказательства специфичности связывания, мы проинкубировали срезы с активированным токсином Cry1Ab, не эффективным против личинок Ae. aegypti. При обоих методах постановки гистохимической реакции окрашивания щёточной каёмки не наблюдалось (рис. 27, 31). Однако при аналогичной постановке опыта происходит связывание активированного токсина Cry1Ab со срезами кишечника Lymantria dispar (Lepidoptera), насекомого, чувствительного к этому белку. Полученные результаты позволяют предположить, что рецепторы москитоцидных белков экспонированы в апикальной мембране столбчатых клеток эпителия, и их расположение по всей прослеженной длине средней кишки довольно равномерное.

Второй структурой, хорошо прокрашиваемой в наших экспериментах (при инкубации как с CryllA, так и с Сгу4В-tox), является перитрофическая оболочка(рис. 26, 28).

Интенсивность окраски перитрофической оболочки не зависела от того, на каком расстоянии от эпителия она располагалась – тесно примыкала или находилась на некотором от него удалении (рис. 28). Связывание перитрофической оболочки с токсинами CryllA и Cry4B-tox тоже специфическое. Оно отсутствует у токсина CrylAb.

Наши данные свидетельствуют о том, что ни внутриклеточные структуры, ни базальные и латеральные мембраны эпителиальных клеток, ни мышечные клетки не связывают токсинов, и, по-видимому, лишены рецепторов связывания.

Рис. 26–31. Визуализация места связывания CryllA и Сгу4В токсинов с эпителием средней кишки личинок комара Ae. aegypti гистохимическими и иммуногистохимическими методами. Стрелки указывают место связывания токсина. Увеличение Х400. Рис. 26, 27. Гистохимический метод. Срезы последовательно обработаны биотинилированными токсинами, конъюгатом стрептавидина с пероксидазой или щелочной фосфатазой и хромогенными субстратами соответствующей энзиматической реакции. В подписи к каждому рисунку указаны токсин, с которым инкубировали срез и конъюгат, используемый для визуализации связавшегося токсина. 26 – биотинилированный CryllA, фосфатазный конъюгат. 27 – биотинилированный CrylAb, пероксидазный конъюгат (контроль). Рис. 28-31.

Иммуногистохимический метод. Срезы последовательно обработаны токсинами, специфическими антителами к токсинам, конъюгатом вторичных антител с пероксидазой или щелочной фосфатазой и хромогенными субстратами соответствующей энзиматической реакции. 28, 29 – CryllA, фосфатазный конъюгат. 30 – Сгу4В, фосфатазный конъюгат. 31 – Cry 1Аb, фосфатазный конъюгат (контроль).

Глава 5. Выделение токсинсвязывающих белков (рецепторов) из мембран кишечного эпителия личинок Anopheles stephensi В настоящее время достаточно хорошо описаны рецепторы эндотоксинов класса Cry1 из кишечного эпителия гусениц. К ним относятся аминопептидазы N и кадгеринподобные белки. Однако очень мало известно о рецепторах москитоцидных белков в мембранах кишечного эпителия двукрылых (Diptera). Недавно в нашей лаборатории были выделены токсинсвязывающие белки из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара Ae. aegypti. Нашей задачей было выделение белков, ответственных за связывание токсинов Cry11A и Cry4B с мембранами кишечного эпителия личинок комаров An. stephensi.

Нами был получен препарат апикальных мембран кишечного эпителия (BBM) личинок An. stephensi. Экстракт, полученный при обработке этих мембран детергентом NONIDET Р40, судя по данным электрофореза, содержал более сорока белков с молекулярной массой от 27 до 100 кДа (рис. 32).

В то же время, если перенести эти полосы на нитроцеллюлозную плёнку и проинкубировать с биотинилированными токсинами Cry11A и Cry4B-tox (лиганд-блоттинг), то с помощью биотин-стрептавидиновой системы проявляются главным образом полоса с молекулярной массой около 65 кДа и менее выраженная полоса с массой 57 кДа. На треках можно также видеть минорные компоненты с меньшей молекулярной массой (рис.

33). Указанные полосы отсутствуют в контроле, в котором реплики обрабатывали биотинилированным бычьим сывороточным альбумином. Полученные данные позволяют предположить, что полосы 65 кДа и, возможно, 57 кДа соответствуют токсинсвязывающим белкам из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара An. stephensi.

Для выделения токсинсвязывающих белков мы синтезировали сорбенты Cry4B- и Cry11А-сефароза. При их использовании для хроматографии белков BBM An. stephensi большая часть последних не связывалась с сорбентами и выходила в проскоке (рис. 34, а).

В то же время 1 М NaCl в обоих случаях элюировал два белка с молекулярной массой 65 и 57 кДа, реагирующих с биотинилированным токсином Cry11А в условиях лигандблоттинга (рис. 34, б). Способность связываться с токсинами, «пришитыми» к аффинным сорбентам, подтверждает наше предположение о том, что 65 и 57 кДа белки могут служить рецепторами москитоцидных токсинов у личинок An. stephensi.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»