WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Дронина Мария Алексеевна Воздействие эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti 03.00.09 – энтомология;

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена в лаборатории химии белка им. В.М. Степанова в ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» и на кафедре энтомологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители: кандидат химических наук И.А. Залунин доктор биологических наук, профессор С.Ю. Чайка

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.А. Рославцева кандидат биологических наук Е.Н. Элпидина

Ведущая организация: Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

Защита состоится 23 апреля 2007 года в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.20 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. Ломоносова.

Автореферат разослан 23 марта 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Л.И. Барсова 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одними из самых перспективных биоинсектицидов являются препараты, полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных подвидов B. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (эндотоксинов), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Diptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства нецелевых объектов. В частности, токсины, продуцируемые Bacillus thuringiensis ssp. israelensis, убивают личинок многих видов комаров и мошек, но безвредны для всей остальной фауны водоёмов.

В основе биологического эффекта -эндотоксинов B. thuringiensis лежит их цитопатологическое действие на эпителиальные клетки кишечника насекомых. В свою очередь, специфичность этих белков определяется их взаимодействием с рецепторами, локализованными в апикальной мембране эпителиальных клеток. Изучение воздействия эндотоксинов на кишечный эпителий, поиск и характеристика соответствующих рецепторов важны для понимания механизма действия и специфичности энтомоцидных белков, а также выяснения путей возникновения у насекомых-мишеней резистентности к препаратам B. thuringiensis. Вследствие этого работы по изучению взаимодействия эндотоксинов B. thuringiensis с кишечным эпителием чувствительных насекомых необыкновенно актуальны.

До настоящего времени основная масса исследований, посвящённых решению указанных проблем, была проведена для токсинов, активных против гусениц чешуекрылых (лепидоцидных белков). Москитоцидные токсины, например Cry4B и Cry11A из подвида Bacillus thuringiensis ssp. israelensis изучены значительно меньше.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было комплексное изучение энтомоцидного действия эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti (Culicidae; Diptera).

Для ее достижения были определены следующие задачи:

- изучение цитопатологических изменений, происходящих в эпителиальных клетках личинок комаров (на примере личинок Ae. aegypti) под действием москитоцидных токсинов Cry4B и Cry11A, продуцируемых B. thuringiensis ssp. israelensis;

- идентификация сайтов связывания токсинов со стенкой кишечника личинок комаров;

- выделение специфического рецептора (ов), ответственного за связывание токсинов кишечным эпителием личинок An. stephensi.

Научная новизна. В работе впервые: всесторонне изучено воздействие эндотоксинов Cry4B и Cry11A на эпителиальные клетки личинок Ae. aegypti; с помощью гистохимических и иммуногистохимических методов визуализировано место связывания этих белков с кишечным эпителием насекомого; выделены 65 и 57 кДа токсинсвязывающие белки из апикальных мембран эпителиальных клеток личинок An. stephensi; высказано предположение, что наряду с выделенными ранее в лаборатории химии белка ГосНИИгенетика токсинсвязывающими белками из Ae. aegypti, эти два белка образуют не описанный ранее класс рецепторов эндотоксинов Bacillus thuringiensis.

Практическая ценность работы. Полученные данные о действии москитоцидных токсинов на кишечный эпителий личинок комаров и о природе рецепторов этих токсинов определяют направления дальнейших исследований механизма москитоцидного эффекта и возможные пути возникновения резистентных линий комаров. В свою очередь, эти исследования позволят в дальнейшем создать биоинсектициды нового поколения с существенно повышенной эффективностью биологического эффекта и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых.

Апробация работы, публикации. Основные положения диссертации представлены на конференции «Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России» (Великий Новгород, 2000), II Республиканской научной конференции (Великий Новгород: НовГУ, 2002), на ХХVII Межвузовской научно-практической конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященной памяти акад. Е.Н. Павловского (С.-Пб., 2000).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 6 научных работах, 3 из которых – в изданиях перечня ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста, содержит 136 рисунков и 5 таблиц, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Список цитированной литературы содержит 179 названий, из которых 7 – на русском языке.

Благодарности. За содействие в выполнении данной работы выражаю свою искреннюю благодарность: моим научным руководителям И.А. Залунину и С.Ю. Чайке за чуткое научное руководство, дбн Д.П. Жужикову за рецензирование рукописи, всем сотрудникам Лаборатории химии белка ГосНИИгенетика и сотрудникам кафедры энтомологии МГУ, а также сотрудникам Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биологического факультета за всестороннюю помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Cry-белки Bacillus thuringiensis: молекулярная структура и механизм действия (обзор литературы) -эндотоксины B. thuringiensis широко изучаются с 50-х годов 20-го века, и к настоящему времени накоплена большая научная литература, посвящённая особенностям структуры, функции, химических свойств и биологической активности этих белков, клонированы гены большого числа -эндотоксинов. В обзоре литературы подробно проанализированы современные данные, касающиеся молекулярной организации Cry-белков, механизма их действия, взаимодействия структуры и функции в молекулах эндотоксинов. Особое внимание уделено освещению взаимодействия Cry-белков с рецепторными белками из кишечного эпителия гусениц – аминопептидазам и кадгеринноподобным белкам. В обзоре приводятся также сведения о наиболее изученных москитоцидных токсинах B. thuringiensis. Представленные данные проиллюстрированы рисунками и схемами.

Глава 2. Материалы и методы 2.1. Получение и модификация -эндотоксинов B. thuringiensis. Москитоцидные белки Cry4B, Cry11A и Cyt1A выделяли из энтомоцидных кристаллов штамма 2395 (B.t.

ssp. israelensis) сочетанием методов избирательной экстракции и анионообменной хроматографии на колонке MonoQ в системе FPLC. Эндотоксины Cry1A и Cry3A получали растворением кристаллов штамма B-9032 ssp. kurstaki и ssp. tenebrionis, соответственно. Чистоту выделенных белков определяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях и двойной иммунодиффузии с использованием специфических антисывороток на выделяемые Cry-белки.

Для получения фрагментов эндотоксина Cry4B с молекулярной массой 64, 50 и 4948 кДа исходный белок обрабатывали, соответственно, химотрипсином, трипсином, или кишечным соком личинок Ae. aegypti. Полученные гидролизаты далее в тексте обозначаются: Cry4B-tox, Cry4B-tr и Cry4B-Аa.

Протеолиз эндотоксина Cry11А с образованием фрагментов 33 и 36 кДа (этот гидролизат далее обозначается Cry11A-tr) и эндотоксинов Cry1A с образованием фрагментов Cry1A-tox (65 кДа) проводили трипсином.

Биотинилирование белков осуществляли N-сукцинимидным эфиром биотина.

2.2. Определение биологической активности. Биологическое тестирование было выполнено на личинках Ae. aegypti второго возраста. Для проведения биотестов с эндотоксинами Cry11A и Сгу4В последние осаждали из растворов с известной концентрацией, добавляя лимонную кислоту до рН 4,5. Насекомых помещали по 10 особей в контейнеры, содержащие суспензию кристаллов B.t. ssp. israelensis (в диапазоне концентраций 0,19 - нг/мл) или эндотоксинов Cry 11А (1 – 250 нг/мл), либо Сгу4В (0,25 - 60 нг/мл) в цитратном буфере. В качестве контроля использовали цитратный буфер. Каждый опыт проводили в 4 вариантах. Погибших насекомых подсчитывали через 24 часа.

По данным этих опытов для последующих экспериментов были выбраны концентрации токсинов, вызывавших как низкий, так и высокий уровень смертности личинок.

2.3. Методика электронно-микроскопического исследования. Изучение влияния кристаллов эндотоксина, а также эндотоксина Cry11A и активированного токсина Cry4B на ультраструктуру кишечника проводили на личинках второго возраста комаров Ae. aegypti.

После инкубации личинок с отобранными концентрациями токсинов в течение указанных интервалов времени их последовательно фиксировали 2,5%-ным раствором глутарового альдегида и 1%-ным раствором четырехоксида осмия, затем контрастировали уранилацетатом и заливали в смесь смол ЭПОН. Ультратонкие срезы окрашивали по методу Рейнольдса и исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM100B.

2.4. Проведение иммуноцитохимических и цитохимических исследований. Для выявления мест связывания москитоцидных токсинов с кишечным эпителием чувствительного насекомого использовали гистологические срезы средней кишки личинок второго возраста комара Ae. aegypti. Для этого отпрепарированные кишечники фиксировали в растворе Буэна, заливали их в парафин и готовили срезы толщиной 6 мкм, которые помещали на предметные стекла. Для проведения реакции срезы депарафинировали в ксилоле и проводили гистохимическое исследование.

В случае иммуногистохимической реакции срезы кишечника насекомого последовательно инкубировали с токсинами (30 мкг/мл), раствором антител, специфических к соответствующему токсину, конъюгатом вторичных антител с одним из ферментов – пероксидазой или щелочной фосфатазой и хромогенными субстратами указанных ферментов. При этом окрашенные продукты энзиматической реакции откладывались рядом с местом нахождения комплекса рецептор – токсин – антитела к токсину – конъюгат и позволяли увидеть под микроскопом те участки клетки, в которых локализованы молекулы рецептора.

Для гистохимической реакции срезы последовательно инкубировали с биотинилированными токсинами и конъюгатом стрептавидина с пероксидазой или щелочной фосфатазой. Дальнейшую обработку срезов проводили по предыдущей схеме. После завершения процедуры окрашивания препараты обезвоживали и заключали в канадский бальзам. Изучение препаратов проводили в световом микроскопе МБИ-3. Фотографирование осуществляли с помощью цифровой фотокамеры Olimpus 3030, соединенной с компьютером.

2.5. Получение препаратов апикальных мембран (brush border membranes, BBM) кишечного эпителия личинок An. stephensi. BBM получали из гомогената средней кишки личинок третьего возраста An. stephensi комбинацией методов осаждения хлористым магнием и дифференциального центрифугирования. В ходе проведённого выделения апикальные мембраны были очищены в 6 раз, что было показано по возрастанию удельной активности маркерного фермента – лейцинаминопептидазы. Белковый состав полученных экстрактов определяли с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия.

2.6. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков An. stephensi.

Аффинные сорбенты Cry11A- и Cry4B-сефароза синтезировали с использованием сефарозы 4В, активированной бромцианом. Мембранные белки экстрагировали, обрабатывая BBM 1%-ным раствором детергента NONIDET P40 в карбонатном буфере, рН 9,5 в присутствии коктейля ингибиторов протеиназ, и наносили на колонку с Cry11A- или Cry4Bсефарозой. Фракции, элюированные с помощью 1,0 М NaCl, хранили при температуре –C.

2.7. Лиганд-блоттинг. В экспериментах по лиганд-блоттингу фракции, полученные в ходе аффинной хроматографии, подвергали электрофорезу по методу Лэммли с последующим электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану. Для предотвращения неспецифического связывания нитроцеллюлозные реплики инкубировали с PBS буфером, содержащим 1 % яичный альбумин и 0,3 % твин, а затем последовательно обрабатывали одним из биотинилированных белков (8 или 4 мкг/мл) и конъюгатом стрептавидина и пероксидазы («Amersham Biosciences»), взятым в разведении 1:1000. Проявление полос, обладающих способностью связывать биотинилированные токсины, осуществляли с помощью ECL-Western blotting analysis system («Amersham Biosciences).

2.8. Изучение связывания 65 и 57 кДа белков An. stephensi с токсинами В. thuringiensis разной специфичности и продуктами ограниченного протеолиза москитоцидных белков Cry11A и Сry4B. Нитроцеллюлозные реплики обрабатывали вышеописанным методом, используя в качестве предполагаемых лигандов следующие биотинили рованные токсины: Cry11A (4 мкг/мл), Cry4B-tox (4 мкг/мл), CytA (8 мкг/мл), Cry1A-tox (мкг /мл) и Cry 3A (8 мкг/мл), а также продукты их ограниченного протеолиза: Cry11A-tr (мкг суммарного белка на 1 мл), Cry4B-tr (4 мкг/мл), Cry4B-Аa (4 мкг суммарного белка на 1 мл).

2.9. Эксперименты по гомологической и гетерологической конкуренции. Нитроцеллюлозные фильтры с перенесенными на них 65 и 57 кДа белками инкубировали с биотинилированным вариантом одного из изучаемых москитоцидных токсинов (Cry 11A или Cry4B-tox) (4 мкг/мл) непосредственно или в смеси с 10-кратным избытком небиотинилированного варианта того же белка (гомологическая конкуренция) или предполагаемого конкурента (соответственно, Cry4B-tox или Cry 11A) (гетерологическая конкуренция). Дальнейшую обработку фильтров проводили, как описано выше.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»