WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Количество ведущих краев 1 - 2 1 - Протяженность активной 5,71±0,05 области, µм Время жизни активной 7,16±0,15 области, мин Глубина ламеллы, µм 4,47±0,79 3,68±0,Время выдвижения 1,22±0,33 0,9±0,ламеллоподии, мин Амплитуда выдвижения 2,36±0,56 0,85±0,ламеллоподии, µм Площадь ламеллоподий, µм 2 95,95±9,.41 Таким образом, при замедлении полимеризации актиновых филаментов на лидирующем крае фибробластов, происходят драматические изменения в его поведении. Уменьшается глубина ламеллы, амплитуда выдвижения ламеллоподии, и замедляется скорость выдвижения ламеллоподии. Что же происходит с ведущим краем при деполимеризации микротрубочек нокодазолом Влияние нокодазола на поведение ведущего края исследовалось в двух разных экспериментах – в первом нокодазол добавляли клеткам, распластывавшимся в чистой среде, на следующие сутки после посадки. Клетки изучались через 2 часа воздействия нокодазола. Во втором случае клетки распластывались в среде с нокодазолом в течение суток.

Поведение ведущего края в этих клетках отличается.

Динамика ведущего края фибробластов, распластанных при нормальных условиях. При добавлении нокодазола к уже распластанным в нормальных условиях клеткам изменения происходят в два этапа. Первый этап – первичный ответ (быстрый, в течение первых 30 минут) – обычно это ретракция клеток, и второй (более медленный, через 1-2 часа после начала воздействия). Исследовалось поведение ведущего края клеток при вторичном ответе на действие нокодазола.

Через 1-2 часа клетки распластаны, но обычно уже не поляризованы. При деполимеризованных микротрубочках фибробласты сохраняют способность к передвижению, однако замедляется динамика движения, что согласуется с данными литературы (Ballestrem et al., 2000). После добавления нокодазола количество ламелл с ведущим (условно) краем увеличивается до 3-6, длина каждого ведущего края уменьшается более чем в 3 раза, каждый ведущий край при этом составляет около 15% от периметра клетки. Время жизни ламеллы с ведущим краем также велико и достигает часа и больше. Протяженность активной области уменьшается и составляет около 13% от длины ведущего края. Время жизни активного края уменьшается и составляет 4,7±0,46 минут (таблица 3). Глубина ламеллы, определяемая на кимограмме, в среднем составляет 6,09±0,84 µм (рис. 6, а).

Рис. 6. Поведение ведущего края в клетках культуры Vero с деполимеризованными микротрубочками.

а – ведущий край, через 2 ч воздействия нокодазола б – ведущий край клетки, распластывающейся в присутствии нокодазола (24 ч) в, г – появление областей с быстрым током актина 2 ч и 24 ч воздействия нокодазола соответсвенно.

Уменьшается глубина ламеллы, амплитуда выдвижения ламеллоподии, однако время выдвижения увеличивается.

Время выдвижения ламеллоподии уменьшается приблизительно в 1,3 раза по сравнению с контрольными клетками (таблица 3). Однако, скорость выдвижения ламеллоподии при деполимеризованных микротрубочках сравнима со скоростью выдвижения ламеллоподии при замедлении динамики полимеризации актина на ведущем крае. Средняя площадь образующихся ламеллоподий уменьшается приблизительно в 3 раза, по сравнению с контрольными клетками (133,30±5,.95 µм2 и 48,27±2,67 µм2 соответственно). В клетках культуры Vero образуются зоны с быстрым током актина (рис. 6, в). Иногда они возникают на уже существующей активной области, однако, так же этот процесс может идти вне связи с активными областями. Время жизни этих областей невелико, обычно не больше 20 минут. В конце существования зона быстрого тока обычно втягивается.

Клетки 3Т3, обработанные нокодазолом, так же теряют поляризацию и не имеют одной ярко выраженной ламеллы. Через час после добавления нокодазола в среду культивирования количество ведущих краев увеличивается до 4 – 6, располагающихся на узких выростах клетки. Во время наблюдения на ведущих краях в клетках с разрушенными нокодазолом микротрубочками также происходит формирование филоподий, но часть филоподий при этом становится длинее, по сравнению с филоподиями в контрольных клетках, и они могут изгибаться. После обработки нокодазолом протяженность ведущего края клетки уменьшается до 25,79±5,01 µм, а протяженность одиночной активной области уменьшается и составляет около 11% от длины ведущего края клетки. Однако общая средняя протяженность всех активных зон в клетках, обработанных нокодазолом, сравнима с общей протяженностью активных областей в контрольных клетках и равна 67,9±5,µм, тогда как в контрольных клетках она составляет 70,2±8,45 µм (рис. 7).

Рис. 7. Диаграмма отношения протяженности ведущего края к суммарной протяженности активных областей в клетках 3Т3.

Протяженность ведущего края при деполимеризованных микротрубочках контроль нокодазол уменьшается почти в 3 раза, однако протяженность ведущего края суммарная протяженность активных зон суммарная протяженность активных областей сравнима с контрольным значением.

Время жизни одиночной активной области в клетках, обработанных нокодазолом, уменьшается почти в 3 раза по сравнению со временем жизни активного края в контрольных клетках и составляет 4,75±0,17 мин. Глубина ламеллы, определяемая на кимограмме, в среднем составляет 7,02±1,23 µм. Скорость выдвижения ламеллоподии уменьшается, по сравнению с контрольными клетками (таблица 3). Средняя площадь ламеллоподий в клетках без микротрубочек снижается в 2 раза по сравнению с площадью ламеллоподий в контрольных клетках. В клетках 3Т3, обработанных нокодазолом, появляется пульсация цитоплазмы.

Таблица 3. Морфометрические характеристики поведения ведущего края фибробластов при деполимеризованных микротрубочках.

Клетки Vero, Клетки 3Т3, Клетки, Характеристика, через 2 часа через 2 часа распластанные в (среднее±S.D.) воздействия воздействия присутствии нокодазола нокодазола нокодазола Периметр клетки, µм 192,34±5,90 216,51±17,42 194,45±1,Протяженность ведущего 28,26±3,04 25,79±5,01 27,45±2,края, µм Количество ведущих краев 4 - 6 4 - 6 2 - Протяженность активной 3,69±1,04 8,48±2,12 4,94±1,области, µм Суммарная протяженность 32,86±7,39 67,9±5,46 активных областей, µм Время жизни активной 4,70±0,46 4,75±0,17 3,80±0,области, мин Глубина ламеллы, µм 6,09±0,84 7,02±1,23 2,72±0,Время выдвижения 0,86±0,24 0,56±0,07 0,57±0,ламеллоподии, мин Амплитуда выдвижения 2,00±0,62 1,81±0,43 0,90±0,ламеллоподии, µм Площадь ламеллоподий, µм 2 48,27±12,67 31,83±10,09 41,53± 9,Поведение ведущего края фибробластов, распластанных в присутствии нокодазола. Поведение ведущего края в клетках, которые распластывались в присутствии нокодазола, иное. Количество ламелл в клетках увеличивается по сравнению с контролем до 2 - 4, длина одиночного «ведущего» края составляет около 14 % от периметра клетки, время жизни каждого ведущего края так же исчисляется часами. Протяженность активной области около 18% от ведущего края, но живет активная область еще меньшее время по сравнению с контрольными клетками. Время жизни составляет 3,8±0,08 мин. Средняя площадь образующихся ламеллоподий составляет 41,53±2,31 µм (таблица 3). Глубина ламеллы меньше приблизительно вдвое, по сравнению с клетками, после двух часов воздействия нокодазола, и в среднем составляет 2,72±0,80 µм. При этом скорость выдвижения ламеллоподии в этих клетках уменьшается приблизительно в 2 раза (таблица 3). В клетках, распластывающихся в присутствии нокодазола, так же возникают зоны быстрого тока актина. Эти зоны перемещаются по кругу по всему периметру клетки, имея при этом практически одинаковую протяженность. Время жизни зон быстрого тока актина занимает несколько минут. Таким образом, при деполимеризованных микротрубочках происходит уменьшение протяженности активной области, по сравнению с контролем и клетками, с замедленной динамикой актиновых филаментов. Также при деполимеризованных микротрубочках увеличивается скорость выдвижения ламеллоподии, по сравнению с клетками, обработанными BDM, однако, площадь образующихся ламеллоподий меньше в клетках с замедленной динамикой актина. Следовательно, полученные результаты позволяют предположить, что для выдвижения ламеллоподий необходимо и достаточно актиновых филаментов, но для увеличения площади ламеллоподии и превращения ее в полноценную ламеллу, необходимо сбалансированное участие обеих систем цитоскелета.

Остается открытым вопрос – какая же из систем отвечает за втягивание активного края Для ответа на него изучалось сокращение клеток под действием BDM при деполимеризованных пучках актиновых филаментов и микротрубочках.

Воздействие BDM на клетки, в которых актиновые филаменты разрушены латрункулином В.Для выяснения роли актиновых пучков в процессе подтягивания ламеллы клетки, было проанализировано поведение клеток в присутствии BDM, в которых микрофиламенты предварительно были деполимеризованы латрункулином В. Контролем служили клетки, культивируемые в нормальной среде. Через 10 минут после введения латрункулина В (5 nM) происходит практически полная деполимеризация пучков актиновых филаментов, однако, ламеллы клеток не втягиваются, и площадь клеток практически не изменяется (2004 ± 125 µм2 в контроле и 2075 ± 133 µм2 после 10 мин воздействия латрункулина В). Эффект латрункулина, таким образом, оказался аналогичным описанному эффекту цитохалазина В и Д в низких концентрациях (Domnina et al., 1982). На систему микротрубочек латрункулин В не влияет. Она остается радиальной, с фокусом схождения на центросоме и прямыми микротрубочками, которые доходят до края клеток, что соответсвует данным литературы (Spector et al., 1983; Peterson et al., 2000). После добавления BDM на фоне латрункулина клетки сокращаются более активно, чем в его отсутствие: уже через 1 мин клетки начинают втягивать активные края (рис. 8). В течение 30 мин площадь клеток уменьшается примерно на 55%. Уже на ранних сроках воздействия BDM сеть микротрубочек становится хаотичной, и исчезает фокус схождения. Таким образом, втягивание лабильных краев происходит в отсутствие актиновых стресс-фибрилл, причем процесс сокращения клетки ускоряется по сравнению с втягиванием при воздействии только одного BDM.

Рис.8. Диаграмма изменения площади клеток Vero при воздействии латрункулина B (1, 5, 10 мин), и латрункулина B + BDM.

Площадь клеток практически не изменяется в контроль 1 5 10 1 5 10 2 0 3 присутствии латрункулина B, однако время воздействия, мин немедленно начинает уменьшаться при добавлении BDM.

Поскольку система микротрубочек в процессе сокращения клеток изменяется, то мы предположили, что микротрубочки могут участвовать в процессе втягивания клеточной ламеллы. Для проверки данной гипотезы микротрубочки деполимеризовали воздействием нокодазола, затем в среду добавляли BDM и оценивали поведение клеток.

Воздействие BDM на клетки, в которых микротрубочки предварительно деполимеризованы нокодазолом. В результате 2-х часовой инкубации с нокодазолом микротрубочки полностью деполимеризуются, но актиновые филаменты в теле клеток сохраняются. Клетки с деполимеризованными микротрубочками теряют поляризацию, и их площадь уменьшается примерно на 20% по сравнению с контролем, что также соответствует ранее описанным данным (Pletjushkina et. al, 2001). Пучки актина в клетках Vero после воздействия нокодазола сильно гипертрофированы по сравнению с контрольными клетками. Хотя после деполимеризации микротрубочек и происходит образование ламеллоподий, количество актина в них снижается. В отсутствие микротрубочек клетки не реагируют на BDM: они остаются распластанными спустя 60 мин инкубации в среде с BDM, и площадь их за это время не изменяется. В дальнейшем в течение суток клетки также не изменяют свою форму. Пучки актиновых филаментов деполимеризуются в ответ на действие BDM медленнее, чем при наличии сети микротрубочек: через 60 мин пучки актина остаются так же гипертрофированными по сравнению с нормальными клетками. В присутствии нокодазола полная деполимеризация актиновых пучков в 90% клеток происходит только после 24 ч воздействия BDM. Прижизненные наблюдения подтвердили, что при добавлении µм площадь клеток/100, нокодазола клетки теряют полярность, но остаются распластанными. В ответ на введение BDM поведение таких клеток не изменяется. Удаление нокодазола из среды культивирования (но не BDM!) приводит к тому, что клетки начинают втягивать края (по всему периметру) примерно через 6 мин, и в дальнейшем в течение 60 мин клетки продолжают поджиматься. Согласно данным иммунофлуоресцентного анализа 6 мин - это время, за которое первые микротрубочки дорастают до края клетки. Изменение площади клеток при восстановлении микротрубочек в присутствии BDM определяли на фиксированных препаратах. Контролем служили клетки, которые после воздействия нокодазола перенесли в чистую культуральную среду. В течение 1 ч площадь клеток в присутствии BDM уменьшается почти вдвое, тогда как в контроле за то же время она 2000.1800.увеличивается (рис. 9).

1600.1400.1200.Рис.9. Диаграмма изменения площади 1000.800.клеток Vero при восстановлении 600.400.200.микротрубочек в контроле и в 0.0 2 6 10 20 30 присутствии BDM.

время восстановления, мин Если в присутствии BDM отмыть нокодазол, контроль в BDM клетки начинают втягивать ламеллоподии через 5-6 мин.

При удалении нокодазола из среды культивирования микротрубочки начинают восстанавливаться уже через 2 минуты, при этом в основном образуются центросомальные микротрубочки и небольшое количество свободных микротрубочек, которые к 6-й минуте восстановления в чистой среде деполимеризуются, что согласуется с данными литературы (Смурова и др., 2002;

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»