WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Результаты и обсуждение. Морфология анализируемых в данной работе клеток Vero соответствует классическому строению фибробласта (Abercrombie, 1978). При редком расположении на стекле клетки поляризованы и активно передвигаются. Их движение описывается типичным локомоторным циклом: происходит выдвижение ламеллы, подтягивание тела клетки с ядром и втягивание хвоста. При этом клетка подтягивается к своему переднему краю и немного ошаривается. Затем цикл повторяется: клетка вновь вытягивает ламеллу и начинает распластываться.

Отношение продольной и поперечной осей (фактор формы) клетки составляет в среднем 3:1. Система актиновых филаментов представлена двумя компонентами: на активном крае содержится достаточно большой пул актина, обеспечивающий выдвижение ламеллоподии, а в теле клетки присутствует небольшое количество актиновых филаментов, которые образуют стресс-фибриллы. Стресс-фибриллы в основном располагаются вдоль длинной оси клетки, однако присутствует и небольшое количество стресс-фибрилл, параллельных активному краю.

Микротрубочки в клетках Vero образуют радиальную сеть. Наиболее плотно микротрубочки располагаются около центросомы, которая является центром организации микротрубочек. Большая часть микротрубочек достигает края клетки, и практически все они остаются прямыми.

Морфометрический анализ динамических характеристик поведения ведущего края фибробластов. При описании поляризованной клетки принято выделять в ней ламеллу с ведущим краем, тело клетки и хвост. Ведущий край еще называют активным. Однако, практически все наблюдения за изменением ведущего края до настоящего времени были сделаны на фиксированных препаратах. Мы смогли более детально проследить изменения в структуре лидирующего края клетки с помощью видеосъемки с короткими интервалами между кадрами (10 секунд и меньше). Наблюдения показали, что сам ведущий край не однороден по своей структуре – в его составе можно выделить активную область, на которой происходит выдвижение ламеллоподий и их втягивание, а так же может происходить раффлинг - выпячивание цитоплазмы вверх, а не параллельно субстрату (Abercrombie M., 1978).

Втягивающаяся область может выдвигаться снова, а может стать спокойной областью. Спокойная область плоская, на ней не происходит ни втягивания, ни выдвижения края. Граница между активной и спокойной областями остается постоянной в секундной шкале времени. Стабильный край, в отличие от спокойной области на ведущем крае – всегда вогнутый, не имеет распластанной ламеллы и остается таковым в часовой шкале времени. Ведущий край можно охарактеризовать следующими величинами – время жизни, длина, процент от периметра клетки.

Ведущий край, если не происходит смена направления движения фибробласта, существует в клетке на протяжении довольно длительного периода времени, который может занимать час и больше, что соответствует данным литературы (Gail and Boone, 1970; Gail, 1972). К описанию активной области можно применить все те же параметры, но время существования этой области значительно меньше, чем ведущего края в целом, и составляет минуты. Так же к описанию активной области применимы дополнительные параметры – время выдвижения края и амплитуда колебаний выдвигающейся и втягивающейся ламеллоподии.

В качестве контроля использовали распластанные клетки на следующий день после посева в чистую среду. Как говорилось выше, эти клетки имеют строение типичное для фибробластов: есть одна ламелла с ведущим краем (реже клетки биполярны, т.е. имеют две ламеллы, отделенные довольно длинными стабильными краями), тело, ограниченное стабильными краями, и хвост. Клетки вытянуты – их фактор формы составляет в среднем 3:1. В экспериментах использовали гомогенную популяцию клеток со сходной площадью.

Ламелла с ведущим краем обычно занимает около половины (47%) от периметра клетки. Глубина ламеллы в среднем составляет около 20 µм. Ведущий край имеет выпуклую форму и ограничен вогнутыми стабильными краями. В клетках Vero существует разделение ламеллы на две зоны – быстрого и медленного ретроградного тока актина. На участке с быстрым током актина чаще всего происходит раффлинг. Активная область обычно занимает около 40% от ведущего края клетки. При этом длина активной области практически постоянна в течение времени наблюдения (рис. 2).

Рис. 2 График изменения длины активной области в клетках 3ТПротяженность активной области в контроле и при деполимеризованных микротрубочках практически не 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.изменяется во времени.

время наблюдения, мин контроль нокодазол протяженность, мкм Время жизни активной зоны в среднем составляет около 14 минут (таблица 1). Затем активная зона, как правило, превращается в спокойную область, а активность ламеллы перемещается в пределах ведущего края. Через некоторое время активность в данной области может возобновиться. Так же на ведущем крае происходит два вида периодических процессов: очень быстрые, не различимые глазом, но определяемые на кимограмме колебания плазматической мембраны, и более медленные выдвижения и втягивания ламеллоподий (рис. 3). Время выдвижения ламеллоподии в активной области занимает 1,07±0,37 мин. Средняя амплитуда (высота) ламеллоподии составляет 7,63±1,92 µм (таблица 1). Средняя площадь образующихся ламеллоподий составляет 133,30±5,95 µм 2.

Рис.3. Поведение ведущего края клеток культуры Vero.

а – интервал между кадрами 5 секунд.

б - интервал между кадрами 1 секунда.

На кимограммах представлено поведение ведущего края фибробластов. Можно различить быстрые флуктуации плазматической мембраны (более темные участки кимограммы) и более медленные выдвижения ламеллоподий. Видна глубокая ламелла.

Масштабный отрезок по вертикали – 20 секунд, по горизонтали 10 µм.

Таким образом, мы смогли детально проанализировать поведение ведущего края фибробластов во времени. Так как использовали малые интервалы между кадрами, то нам удалось выявить ранее не описанную неоднородность строения ведущего края. Чтобы проверить, являются ли данные характеристики универсальными для фибробластов, мы взяли другую линию клеток – 3Т3-Swiss.

Контрольные клетки 3Т3-Swiss так же поляризованы и имеют ярко выраженную ламеллу с одной, реже двумя, активными областями на одном ведущем крае. Ламелла занимает около 48% от периметра клеток. Анализ поведения ведущего края этих фибробластов подтвердил универсальность выбранных нами характеристик для его описания в клетках культуры Vero. Протяженность активной области в клетках 3Т3-Swiss составляет около 46 % от протяженности ведущего края клетки (таблица 1). Протяженность активной области так же практически постоянна во времени (рис. 2). Во время наблюдения на ведущем крае в активной области клетки происходит формирование прямых коротких филоподий, образование ламеллоподий и некоторое смещение всей ламеллы вперед. Время жизни активной области в контрольных клетках составляет 14,17 ± 1,67 мин. Анализ кимограмм показал, что время выдвижения ламеллоподии в активной области занимает 0,62±0,17 мин. Средняя амплитуда (высота) ламеллоподии составляет 3,14±0,94 µм (таблица 1).

Таблица 1. Морфометрические характеристики поведения ведущего края фибробластов в контроле.

Vero, 3Т3-Swiss, Характеристика, (среднее±S.D.) контроль контроль Периметр клетки, µм 208,08±17,01 254,16±18,Протяженность ведущего края, µм.

95,69±10,88 121,66±12,Количество ведущих краев 1 - 2 1 - Протяженность активной области, 33,83±7,8 56,33±10,µм Суммарная протяженность 36,63±6,81 70,2±8,активных областей, µм Время жизни активной области, 14±1,7 14,17 ± 1,мин Глубина ламеллы, µм 19,09±2,39 13,42±3,Время выдвижения ламеллоподии, 1,07±0,37 0,62±0,мин Амплитуда выдвижения 7,63±1,92 3,14±0,ламеллоподии, µм Площадь ламеллоподий, µм 133,30±5,.95 67,17±3,Многолетние исследования показали, что для выдвижения ламеллоподии и дальнейшего движения фибробластов необходимы системы актиновых филаментов, полимеризующихся под углом 700, и микротрубочек. Однако, в свете выявленной нами неоднородности ведущего края, интересно выяснить, как именно они влияют на динамику движения фибробластов Для этого исследовалось поведение ламеллы с ведущим краем при запрете полимеризации актиновых филаментов на лидирующем крае, с помощью BDM, и деполимеризованных нокодазолом микротрубочках.

Эффект воздействия BDM на клетки Vero. В ответ на введение BDM в среду культивирования ламеллы клеток начинают втягиваться через 4 мин воздействия, и за 1 ч воздействия площадь клеток уменьшается примерно на 70% по сравнению с контролем (рис. 4). Отношение продольной и поперечной осей клетки (фактор формы) также изменяется - за 30 мин оно уменьшается до 1:1 (что соответствует ошаренной форме клетки) по сравнению с 3:1 в контроле.

1600.Рис. 4. Диаграмма изменения площади 1400.1200.клеток Vero при воздействии BDM.

1000.Клетки начинают втягивать ламеллоподии 800.600.через 5 мин после добавления BDM в среду 400.200.культивирования. Через 60 мин средняя 0.0 2 4 6 8 10 20 30 60 площадь клеток уменьшается больше чем вдвое.

время воздействия, мин Через 2 минуты после добавления BDM число стресс-фибрилл уменьшается, а оставшиеся становятся тоньше и короче.

Таким образом, наблюдаемые нами изменения в клетках Vero на ранних сроках воздействия соответствуют описанным ранее (Cramer and Mitchison, 1995). Во многих клетках происходит образование звездчатых структур из актиновых пучков.

К 30 мин воздействия происходит практически полная деполимеризация пучков актиновых филаментов: средняя длина пучков микрофиламентов уменьшается втрое, до 4,53 ± 0,45 µм (в контроле - 12,95 ± 1,03 µм), а их количество снижается более чем в 10 раз (с 48 ± 1 в контроле до 4 ± 1). За 60 мин воздействия BDM система актиновых филаментов деполимеризуется практически полностью в 90% клеток. При этом на лидирующем крае клетки происходит быстрая деполимеризация актиновой сети. Сеть микротрубочек под воздействием BDM не изменяется, однако вследствие поджатия клеток на поздних сроках инкубации становится практически невозможно проследить за отдельными микротрубочками. При удалении BDM из среды культивирования клетки вновь распластываются и образуют ламеллы с ламеллоподиями. Таким образом, BDM не только запрещает полимеризацию актиновых филаментов на ранних сроках воздействия (Yarrow et al., 2003), но и вызывает деполимеризацию пучков актиновых филаментов при более длительном (1 ч) действии.

Поведение ведущего края в клетках культуры Vero при запрете полимеризации актиновых филаментов на лидирующем крае. Через 2-3 минуты после добавления в среду культивирования BDM в концентрации 20 мМ ведущий край клетки резко останавливается, а еще через 2-3 минуты начинается быстрое втягивание бывших активных краев клетки. Таким образом, используемая нами ранее концентрация BDM 20 мМ не подходит для детального изучения динамики изменения ведущего края фибробластов. При снижении концентрации BDM до 5 мМ меняется ответ клеток – ведущий край перестраивается более медленно. При перестраивании µм площадь клеток, ведущего края первыми исчезают быстрые процессы колебания плазматической мембраны, а более медленные выдвижения-втягивания ламеллоподий сохраняются, но происходят медленнее, чем в контроле. Ведущий край постепенно сужается.

Уменьшается зона быстрого тока актина до полного исчезновения примерно за минут. На кимограммах видны последовательные события, происходящие на ведущем крае клетки после добавления в среду культивирования BDM в концентрации 5 мМ, – сначала происходит резкое втягивание ведущего края, затем в течение 15-20 минут происходят периодические выдвижения и втягивания ламеллоподий на ведущем крае (рис. 5, а). При этом исчезает зона быстрого тока актина, а ведущий край становится постепенно меньше.

Рис. 5. Изменение поведения ведущего края клеток культуры Vero при воздействии BDM 5 мМ.

а – добавление BDM в процессе съемки, б – через 1ч после введения BDM.

При введении BDM происходит постепенное перестраивание ведущего края, происходят приодические выдвижения более коротких, по сравнению с контролем, ламеллоподий.

Через час после введения BDM ламеллоподии образуются лишь изредка.

Анализ кимограмм показывает, что время выдвижения ламеллоподии незначительно увеличивается, изменяя таким образом скорость выдвижения ламеллоподии приблизительно в 3 раза. Средняя амплитуда (высота) ламеллоподии уменьшается более, чем в три раза. Глубина ламеллы после добавления BDM уменьшается в 4 раза. Средняя площадь образующихся ламеллоподий уменьшается и составляет 95,95±9,41 µм (таблица 2). Через час после введения BDM в концентрации 5 мМ ведущий край так же имеет выпуклую форму и ограничен вогнутыми стабильными краями. Количество ламелл не изменяется по сравнению с контрольными. Однако протяженность ведущего края уменьшается в 1,5 раза (с 98,69±0,88 µм до 58,53±0,48 µм), и он занимает таким образом около 30% от периметра клетки. Активная зона также уменьшается и занимает около 10% от длины ведущего края. Ее средняя протяженность составляет 5,71±0,05 µм. При этом время жизни активной области уменьшается почти в 2 раза (до 7,16±0,15 мин).

Ламелла несколько сужается, ее глубина в среднем составляет 3,68±0,56 µм. Анализ кимограмм показывает, что и средняя амплитуда (высота) и время выдвижения ламеллоподии уменьшаются (рис. 5, б). В дальнейшем ведущий край практически полностью обездвиживается.

Таблица 2. Морфометрические характеристики поведения ведущего края фибробластов при замедлении полимеризации актиновых филаментов на ведущем крае.

Клетки, через Клетки, через Характеристика, 10 мин после 1ч после (среднее±S.D.) добавления добавления BDM BDM Периметр клетки, µм 198,09±5,61 188,59±6,Протяженность ведущего края, - 58,53±0,µм.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»