WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Добринских Евгения Александровна Изучение участия систем микротрубочек и актиновых филаментов в процессе движения фибробластов 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология.

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007 1

Работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант: Доктор биологических наук, профессор, Воробьев Иван Андреевич

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор, Надеждина Елена Сергевна Кандидат биологических наук, Александрова Антонина Юрьевна

Ведущая организация: Федеральное Государственное Учреждение Российский Кардиологический Научнопроизводственный Комплекс Росздрава, лаборатория клеточной подвижности НИИ Экспериментальной кардиологии РКНПК Росздрава.

Защита состоится 20 марта 2007 г. в 15.30 на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В.

Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 16 февраля 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, Е.Н. Калистратова кандидат биологических наук 2 Актуальность проблемы. Способность к направленному передвижению и поддержанию поляризованной формы является фундаментальным свойством животных клеток. На движении клеток основаны многие процессы в организме:

морфогенетические миграции во время эмбрионального развития, передвижение нервных клеток при формировании нервной системы, хемотаксические перемещения клеток крови и иммунной системы и движение фибробластов в процессе заживления раны (Lauffenburger and Horwitz, 1996; Hangan et al., 1997; Montell, 1999).

Движущаяся клетка обладает поляризованной формой – у нее выделяют передний (ведущий) край, выдвигающийся вперед в направлении движения клетки, стабильные боковые края и задний край (хвост), втягивающийся при движении клетки (Abercrombie, 1978; Cramer et al., 1997). Процесс движения клетки довольно долго изучался и изучается в различных лабораториях. Эти исследования позволили установить, что способность клетки к передвижению и поддержанию поляризации обеспечивается ее цитоскелетом - системами актиновых филаментов и микротрубочек (Васильев и др., 1973; Vasiliev, 1991; Mitchison and Cramer, 1995;

Mogilner and Oster, 1996; Cramer et al., 1997; Pollard et al., 2000; Pantaloni et al., 2001).

В процессе движения клетки выделяют несколько фаз. Сначала в направлении движения клетки происходит выдвижение ламеллы – клетка удлиняется. Затем к новому положению ведущего края подтягивается тело клетки с ядром, и происходит вытягивание хвоста. Цикл завершается втягиванием хвоста (Wen-Tien Chen, 1981, Lauffenburger and Horwitz, 1996). Выдвижение ламеллы, инициирующее движение большинства клеток, происходит за счет полимеризации актиновых филаментов, и этот процесс регулируется рядом белков. Большинству типов клеток для направленного движения наряду с актиновой системой необходимы микротрубочки.

Однако роль системы микротрубочек в этом процессе до конца не определена – считается, что при формировании ведущего края микротрубочки полимеризуются в направлении полимеризации актиновых филаментов, однако до сих пор не ясна их роль в процессе подтягивания тела клетки и втягивания хвоста. Относительно роли микротрубочек в движении клетки известно, что они участвуют в поддержании поляризованной формы фибробласта, организуют внутриклеточный транспорт, направляя перемещение органелл и везикул по ламелле к переднему краю клетки (Rodionov et al, 1993; Bershadsky and Futerman, 1994; Wacker et al, 1997). При подавлении транспорта полярность клетки нарушается, и фибробласт перестает ползти (Rodionov et al, 1993).

Анализ литературных данных показал, что локомоция клеток изучалась в основном на фиксированных препаратах или с помощью цейтраферной съемки с существенными интервалами между кадрами, что не позволяет заметить всех изменений на ведущем крае. Так же известно, что системы микротрубочек и актиновых филаментов тесно взаимосвязаны для выполнения такой функции в клетке, как выдвижение ламеллоподии и дальнейшее движение, однако исследованию этой взаимосвязи на живых клетках уделялось очень небольшое внимание. В связи с этим, целью данной работы было прижизненное исследование динамических характеристик ведущего края фибробластов. А так же выяснить, какие элементы цитоскелета (системы микротрубочек и актиновых филаментов) и как влияют на динамические процессы, происходящие на ведущем крае.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать прижизненное поведение ведущего края фибробластов во времени.

2. Описать изменения морфологии клеток, систем микротрубочек и пучков микрофиламентов при запрете полимеризации актиновых филаментов на лидирующем крае с помощью BDM (2,3-бутандионмоноксим).

3. Изучить в динамике поведение ведущего края фибробластов при замедлении полимеризации актиновых филаментов.

4. Изучить динамические изменения поведения ведущего края фибробластов при деполимеризации микротрубочек.

5. Исследовать изменение поведения фибробластов под воздействием BDM при уже разрушенных микрофиламентах.

6. Изучить поведение клеток в ответ на действие BDM при деполимеризации микротрубочек и их восстановлении.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые было показано, что структура ведущего края фибробластов неоднородна. В его составе можно выделить активные области, на которых происходит выдвижение ламеллоподий и их втягивание, и спокойные области. Втягивающаяся область может выдвигаться снова, а может стать спокойной областью. Спокойная область плоская, на ней не происходит ни втягивания, ни выдвижения края. Граница между активной и спокойной областями остается постоянной в секундной шкале времени.

Стабильный край, в отличие от спокойной области на ведущем крае – всегда вогнутый, не имеет распластанной ламеллы и остается таковым в часовой шкале времени. Эти характеристики, по-видимому, универсальны для фибробластов. Они изменяются при различных цитостатических воздействиях.

Также впервые было показано, что без системы микротрубочек в клетке не происходит втягивание активного края.

Было проанализировано восстановление систем актиновых филаментов и микротрубочек в различных условиях. Показано постепенное перераспределение гипертрофированных актиновых пучков в цитоплазме клетки при снятии воздействия нокодазола в системы пучков (стресс-фибрилл) и ламеллярную сеть.

Полученные данные могут быть использованы в лекционных курсах, предназначенных для студентов и аспирантов, специализирующихся в области клеточной биологии.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии 19 октября 2006 года. Результаты работы были представлены на научных конференциях: Всероссийский симпозиум “Клеточная биология на пороге XXI века” Санкт-Петербург, Россия, 2000; “40th American Society for Cell Biology Annual Meeting”, San Francisco, USA, 2000; 17th European Cytoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland, August 31- September 4, 2002; “1-й Съезд Общества клеточной биологии”, Санкт-Петербург, Россия, 2003;

Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре», 17 – 19 октября. СанктПетербург, Россия. Публикации По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура работы Диссертация состоит из глав Введение, Обзор литературы, Материалы и Методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и Список литературы.

Материалы и методы Клеточная культура. В качестве объекта исследования были использованы клетки перевивной линии Vero (фибробластоподобные клетки почки зеленой мартышки, полученные из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН) и фибробластов 3Т3-Swiss (ATCC). Клетки культивировали при 37С и 5% СО2 в среде DMEM с добавлением HEPES 25 мМ (“ПанЭко”, Россия) и 5% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицина (100 мкг/мл). Клетки культивировали в течение суток, высевая их в низкой концентрации на покровные стекла (для экспериментов с фиксированными клетками) или в малые чашки Петри с вмонтированными в дно покровными стеклами (для прижизненных наблюдений).

Экспериментальные воздействия. BDM (“Sigma”, США) добавляли в среду культивирования в конечной концентрации 20 мМ. Клетки фиксировали через 0, 2, 4, 6, 10, 20, 30, 60 минут воздействия и окрашивали для выявления микротрубочек и актиновых филаментов. Удаление BDM из среды культивирования (в экспериментах, где это было необходимо) производили двукратной сменой среды. Для деполимеризации микротрубочек в среду культивирования добавляли нокодазол (“Sigma”, США) в конечной концентрации 4 мкг/мл. Двухчасовая инкубация клеток с нокодазолом приводила к полной деполимеризации микротрубочек. Через 2 ч нокодазол удаляли из среды культивирования путем трехкратной смены среды, и инкубировали клетки в среде без нокодазола в течение 2, 4, 6, 10, 20, 30, 60 мин.

Прижизненные исследования проводили в присутствии нокодазола (4 мкг/мл) или BDM (20 мМ и 5 мМ) в среде культивирования. В ряде экспериментов исследовали последовательное воздействие нокодазола и BDM на клетки. Для этого добавляли BDM (20 мМ) в среду культивирования в момент удаления нокодазола (уже в первую смену среды) и проводили восстановление системы микротрубочек в его присутствии в течение 2, 4, 6, 10, 20, 30, 60 мин. Для исследования комплексного воздействия нокодазола и BDM оба вещества добавляли в среду культивирования последовательно – инкубировали клетки с нокодазолом (4 мкг/мл) в течение 2 ч, затем, не удаляя нокодазол, вводили BDM (20 мМ) и фиксировали клетки через 0, 10, 20, 30, 60 мин и 24 ч. Для разрушения сети актиновых филаментов в среду культивирования добавляли латрункулин В (Calbiochem, США) в конечной концентрации 5 nM на 10 мин. Маточные растворы BDM, нокодазола и латрункулина В готовили, используя диметилсульфоксид (ДМСО). Использованные в экспериментах концентрации ДМСО составляли не более 1% и не влияли на состояние цитоскелета.

Прижизненные наблюдения. Анализ препаратов проводился на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse TE200, с помощью объективов Nikon 40х/0.75 и Nikon 60х/1.4. Полученные изображения посылались в компьютер с помощью охлаждаемой ПЗС камеры CoolSnap HQ (RTE/CCD-1317K/2), управляемой программой Image-Pro Express (Media Cybernetics Inc., США). Экспозиция составляла 0.3 секунды, а интервал между кадрами – 30 и 10 секунд. Эквивалентный размер пиксела составлял при съемке с объективом 40х/0.75 – 3,2 µм и при съемке с объективом 60х/1.4 – 9,5 µм. Во время прижизненных наблюдений на поверхность культуральной среды наносили минеральное масло (Walgreens, США). Для уменьшения фотоповреждения клеток использовали оранжевый светофильтр (ОС-4).

Во время наблюдений температура 35-37°С поддерживалась за счет нагрева объектива и держателя для камеры.

Иммунофлуоресцентные исследования. Клетки фиксировали 1,5% глютаровым альдегидом (“Merck”, Германия) на фосфатном буфере PBS (pH 7,2) 10 минут. После фиксации клетки отмывали от глютарового альдегида путем трехкратной смены буфера PBS (по 10 мин каждая смена). Фиксированные клетки для экстракции обрабатывали 1% раствором Triton X-100 (Sigma, США) на PBS в течение 1,5 ч. Для предотвращения фонового свечения клетки обрабатывали 3 раза по 10 минут 2% раствором NaBH4 (Sigma, США) и отмывали путем трехкратной смены буфера PBS (по 10 мин каждая смена). Для выявления и анализа системы микротрубочек и актинового цитоскелета проводили двойную иммунофлуоресцентную окраску клеток антителами к -тубулину и фаллоидином. Клетки окрашивали фаллоидином, коньюгированным с FITC (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), в разведении 1:16, а затем антителами к -тубулину (Amersham, США) в разведении 1:100. В качестве вторых антител использовали меченные флуорохромом Oregon green антитела (Molecular Probes, США) в разведении 1:100. Окраску каждым из трех антител проводили в течение 30 минут при 37°С. Избыток антител в каждом случае отмывали путем трехкратной смены буфера PBS (по 10 мин каждая смена). Полученные препараты заключали в Moviol 4-88 (Sigma, США) и монтировали на предметных стеклах. Флюоресцентные препараты фотографировали на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse TE200. Съемку проводили с помощью фазовоконтрастных объективов Nikon 100х/1.25 и Nikon 60х/1.4. Полученные изображения посылались в компьютер с помощью охлаждаемой ПЗС камеры CoolSnap HQ (RTE/CCD-1317K/2), управляемой программой WinWiew32 (Princeton Instruments Inc., США). Экспозиция составляла 1 секунду. Эквивалентный размер пиксела составлял при съемке с объективом 100х/1.25 – 0,068 µм и при съемке с объективом 60х/1.4 – 0,105 µм.

Построение кимограмм. В программе MetaMorph (Universal Imaging, США) с помощью специального инструмента Kymograph производили построение кимограммы на каждую активную область ведущего края клетки в течение всего времени съемки. Ширина профиля составляла 200-300 пикселей. Затем на кимограммах обсчитывалось время выдвижения и амплитуда ламеллоподии, глубина ламеллы (рис. 1). Эти характеристики просчитывались для каждой активной области в клетке в течение всего времени наблюдения. Затем значения усреднялись.

Рис. 1. Анализ кимограмм.

На кимограмме представлено изменение поведения ведущего края клеток культуры Vero. Интервал между кадрами в фильме 1 сек.

Тонкая черная линия – амплитуда выдвижения ламеллоподии.

Белая линия – время выдвижения ламеллоподии.

Толстая черная линия – глубина ламеллы.

Анализ полученных данных. Обработка фотографий проводилась в программе Adobe Photoshop (Adobe Inc., США). Полученные фильмы обрабатывались в программе Scion Image (Scion Corporation, США) и MetaMorph (Universal Imaging, США). Статистические данные обрабатывались в программах SigmaPlot (Jandel Scientific, США) и Statistica (StatSoft Inc., США). Достоверность отличий оценивалась по критерию Mann – Whitney (непараметрический анализ).

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»