WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Линейное соотношение зависимостей Rh от времени выполняется до определенного значения времени (t0). При t > t0 зависимость Rh от времени описывается степенной функцией: Rh=Rh,0[1+K1(t-t0)]1/df,где K1 - константа, df - фрактальный размер агрегатов.

Параметр df, полученный для разных концентраций L-кристаллина, приближался к значению 1,8, которое является универсальным для режима агрегации «diffusionlimited cluster-cluster aggregation» (DLCA), при котором скорость агрегации определяется только диффузией взаимодействующих частиц (Weitz and Lin, 1986). В присутствии низких концентраций -кристаллина (0,025 мг/мл, 1:16 :L) размер стартовых агрегатов уменьшается до 31+3 нм, при этом распределение белковых агрегатов по размерам остается унимодальным на протяжении всего измерения. С увеличением концентрации -кристаллина (0,05 мг/мл 1:8 :L) размер стартовых агрегатов продолжает уменьшаться, а унимодальный рост агрегатов в определенный момент времени (при t > 25 мин) переходит в бимодальный и регистрируются два типа частиц (рис. 3). В дополнение к непрерывно растущим во времени агрегатам крупного размера (суперагрегаты) (рис. 3, кривая II) в системе образуются агрегаты конечного размера (рис. 3, кривая I). В присутствии избытка -кристаллина (0,8 мг/мл, 2:1 :L) расщепления агрегатов на две популяции не происходит, а гидродинамический радиус базовых агрегатов при длительной инкубации приближается к предельному значению.

Зависимость Rh от времени t в присутствии -кристаллина удовлетворяет условиям уравнения: Rh = Rh,0exp[K2(t-t0)], где K2 - константа; что свидетельствует о переключении процесса агрегации в кинетический режим «reaction-limited clustercluster aggregation» (RLCA), при котором вероятность слипания агрегатов при столкновении меньше единицы. Таким образом, защитное действие -кристаллина при тепловой агрегации L- кристаллина связано с формированием стартовых агрегатов меньшего размера и сниженной реакционной способности, чем в отсутствие этого шаперон-подобного белка.

Рис. 4 Анализ кинетики УФ-агрегации L-кристаллина. Зависимости параметров кривых агрегации кристаллина ki (А) и Alim (Б) от концентрации белка.

Анализ кинетических кривых УФ-агрегации L-кристаллина. УФиндуцированную агрегацию L-кристаллина изучали в диапазоне концентраций 0,254,0 мг/мл. На рис. 4 видно, что скорость агрегации растет линейно с увеличением концентрации белка в диапазоне 0,25-1,0 мг/мл, а при более высоких концентрациях начинает снижаться. L-кристаллин характеризуется значительным поглощением в УФ-В диапазоне (коэффициент экстинкции 2,3 см2мг-1). Уменьшение скорости агрегации при повышении концентрации белка связано с эффектами экранирования одних молекул другими при УФ-облучении, что уменьшает вероятность фотоповреждения и денатурации белка.

Кинетика УФ-агрегации L-кристаллина в присутствии -кристаллина.

Изучена кинетика УФ-агрегации L-кристаллина (1 мг/мл) в присутствии кристаллина в ряду концентраций 0,06-1 мг/мл. Степень подавления агрегации зависит от концентрации -кристаллина, как и в случае тепловой агрегации. Полное подавление УФ-агрегации в наблюдаемом интервале времени происходит при массовом соотношении L-кристаллина и -кристаллина, равном 1:1, а при тепловой агрегации - 4:1. Вид зависимостей параметров агрегации L-кристаллина ki и t0 от концентрации -кристаллина представлен на рис. 5, В, Г.

Рис. 5. Зависимости параметров ki и t0 от концентрации -кристаллина при тепловой агрегации смеси - и L-кристаллинов (А, Б) и УФ-индуцированной агрегации смеси - и Lкристаллинов (В, Г).

Оценка “экранирующего эффекта” в защитном действии -кристаллина.

Проведена экспериментальная оценка светофильтрующего эффекта -кристаллина в зависимости от массового соотношения :L (шаперон : субстрат). Данные эксперимента показали, что роль светофильтрующей составляющей в защитном действии-кристаллина уменьшается при увеличении количества -кристаллина по отношению к L–кристаллину (рис. 6) При массовом соотношении 1:1 (:L) «экранирующий механизм» составляет около 30% защитного эффекта -кристаллина.

Влияние УФ-облучения на шаперон-подобную активность -кристаллина.

-Кристаллин облучали УФ светом в течение 120 мин при 37°С и регистрировали кривые УФ агрегации смесей L- и -кристаллинов в разных концентрациях.

Рис. 6 «Эффект экрана» в защитном действии -кристаллина. А –схема установки для регистрации кинетических кривых УФ-агрегации, Б - Влияние -кристаллина на скорость УФ-агрегации L-кристаллина при условии, что: -кристаллин находится в передней кювете I как светофильтр (1), -кристаллин находится в кювете II в смеси с L-кристалином (2).

Для каждой агрегационной кривой был проведен анализ завершающей фазы процесса агрегации и рассчитаны параметры ki, Alim и t0. (рис. 7, табл.). При соотношении белков (:) 16:1 доминирующая роль в защите от агрегации принадлежит экранирующему эффекту -кристаллина. Усиление защитной активности Рис. 7. Кривые УФ-агрегации: 1 –L–кристаллин в присутствии необлученного -кристаллина (в массовом соотношении 16:1 :), 2 - L–кристаллин в присутствии облученного кристаллина (в массовом соотношении 16:1 :), 3 - L–кристаллин в присутствии необлученного -кристаллина (в массовом соотношении 4:1 :), 4 - L–кристаллин в присутствии облученного -кристаллина (в массовом соотношении 4:1 :) В таблице справа указаны параметры кривых УФ-агрегации L–кристаллина в присутствии необлученного и УФ-облученного в течение 120 мин -кристаллина облученного -кристаллина становится явным при возрастании связывающей роли кристаллина по отношению к L–кристаллину (:) 4:1. Следовательно, УФ-облучение в примененной нами дозе (поглощенная энергия облучения 1,8 Дж) активирует шаперон-подобные свойства -кристаллина. Известно, что -кристаллин становится более эффективным шапероном при воздействиях, приводящих к частичной денатурации (Srinivas et al., 2003). Мы предполагаем, что УФ в определенных дозах вызывает изменение структуры -кристаллина, усиливающее его шаперон-подобную активность.

Рис. 8. Хроматограммы растворов L-кристаллина (А) и -кристаллина (В): сплошная линия - необлученный белок; пунктирная линия - облученный УФ светом 30 мин; точечная линия – белок, облученный 60 мин. На врезке (А): 1-стандарты, 2- необлученный L-кристаллин; 3- Lкристаллин, облученный 30 мин; 4 - L-кристаллин, облученный 60 мин. На врезке (В): 1стандарты, 2 - необлученный -кристаллин; 3- -кристаллин, облученный 60 мин; 4- кристаллин, облученный 120 мин, Б - спектры флуоресценции (ex = 295 нм) необлученного L-кристаллина (1), облученного 30 мин (2) и 60 мин (3). Г- спектр флуоресценции необлученного -кристаллина (1) и -кристаллина, облученного 60 мин (2) и 120 мин (3).

Влияние короткоцепочечных пептидов на кинетику УФ-агрегации Lкристаллина. Исследуемые соединения добавляли в инкубационную смесь в виде концентрированного раствора, приготовленного на фосфатном буфере. В таблице представлены параметры кривых УФ-индуцированной агрегации L-кристаллина в присутствии карнозина, N-ацетилкарнозина, и анзерина. Как следует из представленных в таблице 1 данных, N-ацетилкарнозин и анзерин в интервале концентраций 10-20 мМ эффективно тормозят процесс фотоагрегации L-кристаллина.

Таблица 1. Изменение параметров кривой УФ-индуцированной агрегации L- кристаллина в присутствии гистидин-содержащих дипептидов.

Повышение концентрации NAC до 40 мМ не приводит к дальнейшему усилению защитного эффекта. В то же время карнозин в концентрации 20-40 мМ не замедляет агрегацию L-кристаллина, а, напротив, ускоряет ее. Поскольку величина ki характеризует скорость взаимодействия агрегатов, то ее возрастание отражает ускорение образования агрегатов достаточно большого размера. В таблице видно, что NAC и анзерин в определенных концентрациях уменьшают величину ki, то есть препятствуют этому процессу. Различие в эффективности тестируемых ГСД можно объяснить их неодинаковой относительной гидрофобностью, влияющей на сродство к фотоповрежденному L-кристаллину. Относительная гидрофобность ГСД была количественно охарактеризована O’Dowd et al. (1988) на основании времени элюции различных дипептидов с помощью обращено-фазной ВЭЖХ, которое составило 2,78±0,01; 3,09±0,01 и 8,46±0,12 мин для карнозина, анзерина и NАС. По-видимому, дипептиды связываются с гидрофобными и экспонированными в раствор участками УФ-поврежденного L-кристаллина, и, образуя «заплатки», частично блокируют агрегацию. Это предположение согласуется с полученными нами данными по антиагрегационной активности дипептидов при действии на L-кристаллин. В присутствии D-пантетина концентрационно-зависимо уменьшается скорость агрегации Lкристаллина (данные не представлены), что позволяет связать уменьшение скорости агрегации с экранирующим эффектом пантетина.

Влияние короткоцепочечных пептидов на разделенную УФ-агрегацию Lкристаллина. Для выявления стадии, на которой эффективны дипептиды, мы разработали метод разделения во времени процессов УФ-повреждения и агрегации кристаллинов. L-Кристаллин облучали УФ светом при 15°С, а затем прекращали облучение и индуцировали агрегацию, нагревая образец до 37°С. Во время УФоблучения низкая температура раствора препятствует агрегации белковых молекул, поскольку скорость агрегации зависит от скорости диффузии частиц.

Рис. 9 Кинетика агрегации (37°С) Lкристаллина, предварительно облученного УФ при низкой температуре (15°С). А - дипептиды добавлены после УФО, Б - дипептиды добавлены перед началом УФО. 1 - Lкристаллин, 2 - L-кристаллин в присутствии 20 мМ NAC, 3 - Lкристаллин в присутствии 20 мМ анзерина.

Нативный L-кристаллин не агрегирует при 37°С, поэтому агрегация УФоблученного белка свидетельствует о его фотоповреждении. На рис. 9, А показаны кинетические кривые агрегации белка, полученные при добавлении дипептидов перед индукцией агрегации при 37°С. На графике видно, что NAC в концентрации 20 мМ ускоряет агрегацию предварительно облученного L-кристаллина, в то время как анзерин в той же концентрации снижает скорость и увеличивает лаг-фазу процесса агрегации. На рис.9, Б представлены кривые агрегации, полученные при добавлении дипептидов перед началом УФО при 15°С. В этом случае L-кристаллин, облученный в присутствии 20 мМ NAC агрегирует медленнее, чем контрольный белок. Анзерин, как и в первом случае, замедляет скорость и увеличивает лаг-фазу процесса агрегации белка.

Влияние короткоцепочечных пептидов на кинетику тепловой агрегации Lкристаллина. Исследуемые вещества мы добавляли в кювету с раствором Lкристаллина при 60°С и анализировали кривые агрегации белка. В таблице 2 показаны Таблица 2. Изменение параметров кривых тепловой агрегации L-кристаллина в присутствии короткоцепочечных пептидов (20 мМ) Параметры кривых агрегации Инкубационная смесь, 60С ki, мин-1 t0, мин Аlim, ОЕ 0,134 ± 0,003 7,86 ± 0,11 1,125 ± 0,L 0,150 ± 0,002 7,10 ± 0,14 1,190 ± 0,L + карнозин 0,192 ± 0,002 7,77 ± 0,16 1,058 ± 0,L + NAC 0,161 ± 0,002 6,77 ± 0,13 1,200 ± 0,L+ анзерин 0,19 ± 0,006 8,76 ± 0,09 1,14 ± 0,L + пантетин параметры кривых тепловой агрегации L-кристаллина в присутствии КЦП. Как следует из представленных данных, все исследуемые вещества в концентрации 20 мМ действуют с одинаковой направленностью – ускоряют тепловую агрегацию, о чем свидетельствует увеличение ki по сравнению с контролем. Добавление пантетина, в отличие от ГСД, продлевает лаг-фазу агрегации белка.

Влияние короткоцепочечных пептидов на количество карбонильных групп в L-кристаллине при УФ-облучении. Появление карбонильных групп в аминокислотных остатках белков является маркером окислительной модификации (Berlett, Stadtman, 1997). Известно, что УФ-облучение вызывает повреждение белка, протекающего по механизму свободно-радикального окисления. В то же время имеются обширные данные по антирадикальной активности ГСД (Boldyrev, 2006).

Данные таблицы 3 показывают, что при освещении раствора L-кристаллина УФ светом в течение 40 мин количество карбонильных групп повышается, примерно, на порядок. Это свидетельствует о повреждении белка по механизму свободнорадикального окисления. Однако ни N-ацетилкарнозин, ни карнозин, ни анзерин существенного влияния на количество карбонильных групп не оказывали.

Таблица 3. Содержание карбонильных групп в L-кристаллине при действииУФ-света в присутствии гистидин-содержащих дипептидов (20мМ) Количество карбонильных групп (нмоль/мг Образец белка) после УФ-облучения в течение:

0 мин 40 мин 0,53±0,13 5,96±0,L-кристаллин 0,52±0,11 5,16±0,L + карнозин 0,51±0,14 5,10±0,L + NAC 0,52±0,14 5,20±0,L+ анзерин Это означает, что исследованные дипептиды не предупреждают окислительного повреждения L-кристаллина в используемой нами модели.

Влияние короткоцепочечных пептидов на размеры частиц L-кристаллина при УФ-облучении. Общим эффектом для активных дипептидов (NАС, анзерин) оказалось их действие на стадии УФ облучения, то есть на стадии формирования агрегирующих частиц. Такое воздействие, вероятно, реализуется посредством единого механизма. Мы предполагаем, что причиной торможения УФ-индуцированной агрегации L-кристаллина в присутствии дипептидов может быть встраивание ГСД в Рис. 10. Распределение частиц по размерам в растворе L-кристаллина при 15°С. 1 - Lкристаллин (сплошная линия); 2 - L-кристаллин + УФ 60 мин (пунктирная линия); 3 - Lкристаллин + 20 мМ Nацетилкарнозина + УФ 60 мин (линия точками); 4 - Lкристаллин + 20 мМ анзерина + УФ 60 мин (линия штрихпунктиром).

поврежденную молекулу L-кристаллина. Такое встраивание предупреждает конформационные перестройки в белке, которые приводят к экспонированию наружу молекулы гидрофобных участков, обычно скрытых в глубине молекулы. На рис. представлено распределения частиц по размерам в растворах L-кристаллина:

контрольном, облученном УФ, и растворе, облученном УФ в присутствии гистидинсодержащих дипептидов. Гидродинамический диаметр частиц в растворе Lкристаллина при 15°C варьирует от 2,33 до 15,7 нм, со значением моды 5,62 нм. Такой разброс значений – результат как особенностей метода ДЛС, так и того, что Lкристаллин в норме образует ассоциаты (Hejtmancik et al., 2004). Добавление дипептидов к нативному L-кристаллину не влияет на размеры ассоциатов. УФ облучение L-кристаллина вызывает образование популяции более крупных частиц, размером порядка 20–50 нм, и распределение частиц становится бимодальным.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»