WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ДИЖЕВСКАЯ АНТОНИНА КОНСТАНТИНОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ШАПЕРОН-ПОДОБНОЙ АКТИВНОСТИ -КРИСТАЛЛИНА И КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫХ ПЕПТИДОВ 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В.

Ломоносова и в лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович Кандидат биологических наук Муранов Константин Олегович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Гомазков Олег Александрович Кандидат биологических наук, доцент Калинина Елена Валентиновна

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится 25 мая 2009 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан апреля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Медведева М.В.

2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. -Кристаллин, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, обладает шаперон-подобной активностью и подавляет агрегацию дестабилизированных белков в клетках хрусталика, преимущественно - и кристаллинов. Взаимодействие -кристаллина с - и -кристаллинами в хрусталике глаза играет важную роль в поддержании прозрачности и светопреломляющих свойств этого органа. Агрегация структурных белков является ключевой стадией развития стойкого помутнения хрусталика, или катаракты. Согласно современным патогенетическим воззрениям, катаракта относится к так называемым «конформационным заболеваниям» и возникает при нарушении фолдинга кристаллинов с последующей агрегацией на фоне ослабления шаперон-подобной функции -кристаллина в клетках хрусталика (Harding, 1998; Bloemendal et al., 2004).

Предотвращение или замедление агрегации цитоплазматических белков в клетках хрусталика является перспективным способом профилактики и консервативного лечения катаракты. Поэтому актуален поиск соединений, подавляющих агрегацию белков или усиливающих защитную активность -кристаллина. В работах in vitro показано, что короткоцепочечные пептиды способны препятствовать тепловой агрегации белков (La Rosa et al., 2005), усиливать шаперон-подобную активность кристаллина (Clark and Huang, 1996) и проявлять собственную шаперон-подобную активность (Sharma et al., 2000; Ghosh et al., 2007). По данным лабораторных и клинических исследований, природные короткоцепочечные пептиды карнозин, Nацетилкарнозин и пантетин эффективны при профилактике и лечении катаракты различной этиологии (Аветисов и соавт., 2008; Болдырев, 1999, Babizhaev et al., 2002, Clark et al., 1996, Williams and Munday, 2006). Карнозин и его производные относятся к группе гистидин-содержащих дипептидов (ГСД), пантетин – природный тетрапептид, структурный компонент кофермента А. Молекулярные механизмы антикатарактального действия этих соединений не ясны. Предполагают, что в основе действия карнозина и N-ацетилкарнозина лежит способность тормозить процессы свободно-радикального окисления в клетках хрусталика, или (и) снижать уровень гликирования белков (Babizhaev et al., 2002, Boldyrev, 1999). Мы предположили, что клинический эффект короткоцепочечных пептидов может быть связан с торможением агрегации белков хрусталика. Настоящая работа посвящена исследованию влияния короткоцепочечных пептидов на агрегацию кристаллинов с использованием специально разработанных нами моделей агрегации белков in vitro.

Целью работы является сравнение шаперон-подобного действия -кристаллина и природных короткоцепочечных пептидов (карнозина, N-ацетилкарнозина, анзерина и пантетина) на агрегацию кристаллинов, основанное на анализе кинетики агрегации L-кристаллина бычьего хрусталика Задачи исследования:

1 Разработать экспериментальные модели УФ-индуцированной и тепловой агрегации L-кристаллина и смеси - и L-кристаллинов;

2 Изучить кинетику тепловой агрегации L-кристаллина при 60С и УФиндуцированной агрегации L-кристаллина при 37С;

3 Охарактеризовать шаперон-подобную активность нативного и УФоблученного -кристаллина на основании анализа кинетики агрегации смеси - и L-кристаллинов;

4 Оценить эффекты короткоцепочечных пептидов на кинетику тепловой и УФиндуцированной агрегации L-кристаллина смесей - и L-кристаллинов;

5 Охарактеризовать взаимодействие короткоцепочечных пептидов с кристаллинами.

Научная новизна. Настоящая работа представляет собой оригинальное исследование, в котором впервые количественно охарактеризовано влияние различных короткоцепочечных пептидов на кинетику агрегации L-кристаллина и смесей - и Lкристаллинов, и на основании экспериментальных данных предложен механизм их действия. В работе использована оригинальная установка, разработанная для регистрации кинетических кривых агрегации белка при УФ-облучении в режиме реального времени. Установлено, что N-ацетилкарнозин и анзерин дозо-зависимым образом замедляют процесс УФ индуцированной агрегации L-кристаллина, что сопровождается уменьшением размеров агрегатов белка. D-пантетин, в отличие от ГСД, дозо-зависимым образом замедляет УФ индуцированную агрегацию смеси - и L-кристаллинов, что связано со специфической модификацией активности кристаллина D-пантетином. Показано, что облучение ультрафиолетом усиливает шаперон-подобную активность -кристаллина по отношению к L-кристаллину в связи с конформационной перестройкой -кристаллина под действием УФ света.

Практическое значение работы. Обнаруженные нами анти-агрегационные свойства короткоцепочечных пептидов позволяют рекомендовать их для дальнейшего исследования действия на кристаллины хрусталика в условиях in vivo. Выяснение структурно-функциональной взаимосвязи короткоцепочечных пептидов в отношении торможения агрегации белков может стать основой для создания нового класса антикатарактальных препаратов-антиагрегантов. Успехи в этом направлении могут стать основой для раскрытия механизмов катарактогенеза на молекулярном уровне и направленного синтеза антикатарактальных препаратов пептидной природы, способных блокировать агрегацию белков хрусталика или/и усиливать шаперонподобную активность -кристаллина.

Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы были доложены на ХII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2005), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), II Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2007), на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ им.

М.В.Ломоносова (2008). По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, среди которых 2 статьи в изданиях, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 44 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 206 отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ - и L-Кристаллины выделяли из хрусталика глаза быка по модифицированному методу Chiou et al. (1979). Кортекс хрусталика подвергали гомогенизации и центрифугированию (30 000 g 30 мин), затем проводили эксклюзионную хроматографию супернатанта, содержащего смесь растворимых белков, и собирали фракции - и -кристаллинов. Для дополнительной очистки L-кристаллина проводили эксклюзионную хроматографию -кристаллина на колонке с гелем Sephacryl S-200 (Pharmacia, Швеция), в результате которой получали L-кристаллин с молекулярным весом, равным 35 кДа. Концентрацию - и L-кристаллинов определяли по поглощению при 280 нм, используя коэффициенты экстинкции 0,85 см2мг-1 и 2,см2мг-1 соответственно. Короткоцепочечные пептиды карнозин (-аланил L-гистидин, C9H14N4O3, FW - 226), N-ацетилкарнозин (C11H16N4O4, FW - 268) и анзерин (-аланилN1-метилгистидин, C10H16N4O3, FW - 240) производства «Hamari Chemicals Ltd.» (Япония), D-пантетин (C22H42N4O8S2, FW - 554,7) - «Sigma-Aldrich» (США).

Полипептидный состав - и L-кристаллина контролировали с помощью электрофореза по методу Laemmli (1970) в 12,5% ПААГ в присутствии ДСН. Для индукции УФ-агрегации раствор L-кристаллина или смеси - и L-кристаллинов в 40мМ фосфатном буфере (рН 6,8) помещали в кварцевую кювету и облучали при 37С с помощью лампы ДРШ-1000, снабженной светофильтром УФС-2 (260–310 нм).

Суммарная мощность световой энергии поглощенной образцом в указанном диапазоне была определена с помощью оптического спектрометра AvaSpec-2048 (Нидерланды) и составляла 255,6 + 25,5 мкВт. Для индукции тепловой агрегации раствор белков помещали в кювету, термостатируемую при 60С. Исследуемые пептиды добавляли к раствору белков непосредственно перед индукцией агрегации. Общий объем инкубационной смеси в пробе составлял 0,4 мл. Кинетические кривые агрегации получали, регистрируя светорассеяние раствора белков при = 405 нм с помощью специально сконструированного нефелометра (рис. 1). Для количественной оценки параметров кривых агрегации использовали метод, разработанный Кургановым (2002).

Рис. 1. Схема установки для УФоблучения белков и регистрации процесса агрегации in vitro. Лампаоблучатель снабжена фильтром УФС-2, пропускающим УФ свет в интервале 260–310 нм. Изменение светорассеяния раствора регистрировали при помощи светодиода (405 нм).

Участок S-образной кривой агрегации после перегиба аппроксимировали уравнением реакции псевдопервого порядка A=Alim (1-e-ki (t-to)), получая три параметра, описывающих процесс помутнения раствора: to – время лаг-фазы процесса, которое отражает скорость денатурации L-кристаллина под действием ультрафиолета; ki - константа скорости реакции, которая описывает скорость взаимодействия поврежденных молекул друг с другом; Аlim – максимальная мутность инкубационной смеси, отражающая конечный размер агрегатов. Экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистического пакета Statistica 6.0 (StatSoft Inc, США).

Количество карбонильных групп, образующихся при УФО кристаллинов, определяли методом Levine et al. (1994). Данные представлены в виде среднее±стандартная ошибка. Для оценки достоверности изменений применяли тест Стьюдента (достоверность при р 0,05). Измерения собственной флуоресценции растворов кристаллинов проводили на спектрофлуориметре Hitachi-850 (Япония) при длинах волн возбуждения 295 нм, испускания в интервале 300-400 нм. Для характеристики размеров молекул и агрегатов кристаллинов в растворе применяли метод динамического лазерного светорассеяния (ДЛС). Измерения проводили на установке Zetasizer Nano Series с He-Ne лазером (633 нм), снабженной пакетом программ полидисперсного анализа Dispersion Technology Software 4.2 (Malvern Instrument Ltd, Великобритания), проводящих обработку автокорреляционных функций и расчёт гидродинамического диаметра частиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ кинетических кривых тепловой агрегации L-кристаллина. Кинетику тепловой агрегации L-кристаллина мы исследовали в интервале концентраций 0,2-2,мг/мл. Зависимости параметров теоретических кривых агрегации от концентрации приведены на рис. 2.

Рис. 2, А - Кинетические кривые тепловой агрегации L-кристаллина при 60С, А концентрация белка: 0,2 (1), 0,4 (2), 1,0 (3) и 2,0 мг/мл (4) и параметры кинетики тепловой агрегации L-кристаллина ki (Б), t0 (В), Alim (Г), полученные при различных концентрациях белка.

Параметры ki и Alim линейно зависят от концентрации (рис. 2, Б, Г), что согласуется с данными по тепловой агрегации других белков (Курганов, 2002; Wang, Kurganov, 2003). При этом зависимость величины ki от концентрации белка указывает на то, что реакция имеет псевдопервый порядок. Зависимость лаг-периода t0 от концентрации имеет логарифмический характер (рис. 2, В).

Кинетика тепловой агрегации L-кристаллина в присутствии кристаллина. При анализе кинетических кривых тепловой агрегации L-кристаллина (0,5 мг/мл) в присутствии -кристаллина (0,025-0,125 мг/мл) установлено, что с увеличением количества -кристаллина в смеси увеличивается лаг-период агрегации и снижается скорость процесса (рис. 5, А, Б). Полное подавление тепловой агрегации Lкристаллина в течение наблюдаемого периода происходит при массовом соотношении L:, равном 4:1. Уменьшение константы скорости в присутствии -кристаллина свидетельствует о снижении скорости процесса взаимодействия белковых агрегатов.

Удлинение лаг-фазы обусловлено увеличением количества L-кристаллина, связанного с -кристаллином и исключенного из процесса агрегации.

Рис. 3 Влияние -кристаллина на кинетику агрегации L-кристаллина (0,мг/мл) при 60°C. Зависимость величины гидродинамического радиуса (Rh) от времени полученная при концентрации -кристаллина 1 - 0 мг/мл, 2 - 0,075 мг/мл и 3 - 0,15 мг/мл. Кривые I и II относятся к суперагрегатам и комплексам стартовых агрегатов с кристаллином, соответственно.

Механизм шаперон-подобной активности -кристаллина при тепловой агрегации L-кристаллина. Механизм защитного действия -кристаллина при тепловой агрегации L-кристаллина был предложен нами в совместной работе с Б.И.Кургановым (лаборатория ферментных систем Института биохимии им. А.Н. Баха РАН) (Тимофеева и соавт., 2005, Khanova et al., 2005, Markossian et al., 2006).

Предложенный механизм включает в себя стадии образования стартовых агрегатов и дальнейшей их ассоциации с образованием агрегатов высшего порядка. Было установлено, что начальные участки зависимостей интенсивности светорассеяния (I) от гидродинамического радиуса частиц (Rh) линейны. Размер стартовых агрегатов (Rh,0) можно определить как отрезок, отсекаемый на оси абсцисс линейной зависимостью I от Rh. Размер стартовых агрегатов не зависит от начальной концентрации белка. Стартовые агрегаты L-кристаллина имеют размер 84 ± 4 нм.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»