WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

РЕЗУЛЬТАТЫ Субпопуляции В-лимфоцитов у больных раком молочной железы: Lecспецифичные В-клетки.

Показатели В - клеточного звена иммунитета были проанализированы у первичной больной РМЖ (до лечения).

Средний возраст больных составлял 56,8 лет ± 2,4 года. Возрастные показатели колебались в пределах от 35 до 75 лет, медиана составила 56 лет.

Контрольная группа включала 9 женщин в возрасте от 27 до 49 лет (здоровых доноров, 3 пациентки с фиброаденомой молочной железы).

У всех пациенток были оценены уровни экспрессии основных антигенов, позволяющих судить о степени зрелости, активации и субпопуляционном составе В-лимфоцитов (CD 19+).

На первом этапе анализа идентифицировали В-клетки и определяли их процентное содержание в пределах лейкоцитов CD45++ как показано на рисунке 1.

Далее в пределах гейта В-лимфоцитов определяли экспрессию различных дифференцировочных антигенов на клетках.

А Б В Рис. 1. Гейт для анализа субпопуляционного состава В-клеток.

А. Выделение гейта лейкоцитов на основании экспрессии CD45 (ось Х - экспрессия CD45 FITC, гейт R1, на цитограмме выделен красным цветом) Б. Гейт В-клеток ( CD19+ ) - R2. По оси абсцисс экспрессия В-клеточного антигена CD19 PE/Cy5.

Показатели крови и уровни содержания В-клеток в контрольной группе были в пределах нормы.

Средние уровни В-лимфоцитов больных составили 7,6±0,8% от всей популяции лимфоцитов при медиане 7,5% и разбросе 0,7- 13,8 %.

В целом по группе В-клетки (CD19+) характеризовались мономорфной экспрессией CD 20 и НLА DR, отсутствием CD10, наличием CD38 на части клеток.

Большинство В-клеток экспрессировали мембранные Ig М. Содержание Влимфоцитов с различными изотипами иммуноглобулинов было следующим: IgM 85,2% ± 2,8 (49,2 – 99,4%), IgG – 18,7%±5,7 (1,2-96,7%), IgA 10,4%±1,3 (1,9-22,4%).

В-клетки были поликлональны по типам легких цепей мембранных иммуноглобулинов: Ig в среднем 62,6±2,3%, Ig 36,3±2,1%. В одном случае отмечено явное преобладание (моноклональность) каппа-типа В-лимфоцитов.

В значительном проценте изученных образцов (18 из 20 – 90% от всех случаев) на В-клетках выявлялась экспрессия активационного антигена CD23 (от 32,8 до 94,5%) одновременно с экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости II типа (HLA DR).

В 7 из 19 изученных случаев (36,8%) на В- клетках (CD19+CD20+) выявлялась экспрессия антигена CD5 (от 22,1 до 48,3%). У 14 из 19 больных (73,6%) В-клетки коэкспрессировали активционный антиген CD38 с разбросом от 25,4% до мономорфной экспрессии (98,3%).Экспрессия молекул CD71, CD10, CD95 была гетерогенной. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4. Иммунофенотипическая характеристика В-лимфоцитов у больных раком молочной железы и в контрольной группе Антиген %% В-клеток Среднее±ош.ср.; Разброс; n Р (дост.

различий) Больные РМЖ Доноры CD 10 0,11,1±2,9%; 12,7±1,4;

0,0-49,7; 19 6,7-17,4; CD 71 0,22,4±3,5; 12,6±2,7;

0,9-55,8; 19 2,2-21,2; СD 95 0,9,2±1,5; 8,4±1,9;

0,1-25,1; 19 1-16,1;CD23 0,59,5±5,5; 39,3±4,8;

1,9-94,5; 20 21,4-58,9;CD5 0,21,9±3,3; 23,2±5,0;

4,6-48,3; 19 8,5-50,9;CD20 0,97,0±0,5; 97,9±0,6;

90,3-99,9; 19 95-100;CD38 0,49,2±6,8; 7,1-98,3; 19 44,1±4,1; 25-58,7; Достоверных различий между сравниваемыми группами по большинству популяций не выявлено. Содержание CD23 позитивных клеток было достоверно выше у больных раком молочной железы.

У всех пациенток нами проанализировано наличие специфических рецепторов к дисахариду Lec на мембране В-лимфоцитов на основании способности В-клеток связывать опухолеассоциированный дисахарид Gal13GlcNAc (Leс) в составе флуорохромного зонда Leс-PAA-flu (в дальнейшем обозначаемым Leс). В качестве контроля к Leс использовался меченый флуорохромом лактозамин - дисахарид, схожий по структуре с Leс (Gal14GlcNAc). Флуоресцентно меченые пробы были любезно представлены профессором Н.В.Бовиным (ИБХ, Москва).

У 85% больных РМЖ (18 из 21) и у 75% доноров (6 из 8) выявлялись Вклетки, связывающие дисахарид Leс. Средние уровни Leс-связывающих В-клеток у больных РМЖ составляли 6,0% (0,73 - 32,0%, Ме - 2,5%), у доноров соответственно- 5,4% (1,5-16,0%), различия не достоверны: р = 0,31. В-клетки, связывающие большие количества Lec и дающие яркий флуоресцентный сигнал при проточно-цитометрическом анализе, выявлены в 67% (14 из 21) больных раком молочной железы: 0,6 - 3,9% (Ме - 0,9%).

Пример связывания Leс с В-клетками, включая клетки с ярким флуоресцентным сигналом, представлен на рис.2.

Рис. 2. Пример выраженной экспрессии Lec на В-лимфоцитах. CD19+ В- лимфоциты накоплены в гейте R2. Оценка экспрессии CD5 (PE, ось Y) и связывания Leс (FITC – ось Х). Около 50% Lec-связывающих В-лимфоцитов составляют CD5+ В-клетки (1,5% клеток Lec+ CD5+, общее количество Lec+ - 3,13%).

Одним из направлений работы явилась оценка связывания Lec с субпопуляцией CD5-позитивных В - клеток. Именно эти клетки, как известно, во многом определяют антительный ответ на углеводные антигены и продуцируют т.н. естественные антитела IgM класса.

Lec+ CD5+В-клетки были оценены в 12 случаях из 21. Во всех случаях рецепторы к Lec+ были экспрессированы как на CD5-позитивных, так и на CD5негативных В-лимфоцитах. CD5-позитивные В- клетки составляли в среднем 50% от В-клеток, высокоаффинных к Lec+, как представлено на рис. 2.

Таким образом, полученные в работе данные свидетельствуют о гетерогенности В-лимфоцитов у больных раком молочной железы. По большинству маркеров они были сходны с донорской группой, лишь пропорция CD23-позитивных В-клеток была более выраженной у больных раком молочной железы.

Отмечено связывание флуоресцентно меченого дисахарида Gal1-3GlcNAc В-лимфоцитами больных раком молочной железы и В-лимфоцитами доноров.

Впервые показано, что мембранные рецепторы CD5-позитивных В-лимфоцитов способны связывать дисахарид Gal1-3GlcNAc. Это может служить указанием на участие данной популяции клеток в противоопухолевом иммунном ответе на раковые клетки, экспрессирующие изучаемую углеводную детерминанту на мембране.

Показатели гуморального противоопухолевого иммунитета у больных первичным операбельным раком молочной железы.

Мы проанализировали, существуют ли взаимосвязи между наличием (уровнями) Gal1-3GlcNAc (Lec)-специфичных В-лимфоцитов и клиническими характеристиками рака молочной железы, уровнями MUC1 (антиген, в структуре которого присутствует детерминанта Gal1-3GlcNAc), концентрацией иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови и некоторыми другими показателями.

Клиническая характеристика больных во взаимосвязи с наличием и процентом Lec-специфичных В-клеток представлена в таблице 5.

Таблица Клиническая характеристика больных и содержание Lec-специфичных В-клеток №пп Инициалы TNM Клиническая Размер Процент Lec стадия опухоли специфичных (см) В-клеток (CD19+) 1 Ж-а Т4N0М0 IIIб 1,5х1,5 3,2 Сач-а Т2N1pN0М0 IIб 2,0х2,5 2,3 З-а Т4N2М0 IIIб 5,0х5,5 1,(мульт) 4 А-а Т1N0M0 I 1,0х1,5 0,(мульт) 5 Кол-а Т4N1pN2M0 IIIб 4,0х3,0 0,6 Л-а T2pT1N1pN0M0 I 2,0х1,5 1,(мульт) 7 В-а T1N1M0 II а 1,0 х 1,2 1,8 Я-а T3(pT1)N2(pN1) IIа 2,0 х 2,0 2, M9 Сиз-а T4(pT2)N1(pN2) III б 2,5 х 2,7 M10 Куз-а T2N0M0 II a 2,0 x 1,5 11 Мол-а Т3N1M0 III a 7,0 x 5,0 12 Л-е Т4N2M0 IIIб нет 2,13 Ч-а Т1N0M0 I 2,0х2,0 14 Н-а Т1N1M0 IIа 1,5х1,0 (мульт) 15 С-а Т1N1M0 IIа 0,16 Л-а Т2N1M0 IIб 3,0х3,0 (мульт) 17 Т-а Т2N1pN2M0 IIIa 2,8х2,7 1,18 Мер-а Т2N0M1 IV 4,0х4,5 19 Б-а Т2N1pN2M0 IIIа 2,5х2,8 0,20 А-а Т2N0M0 IIа 3,5х2,0 1,21 К-а Т2N0M0 IIа 1,Отмечена вдвое более высокая частота опухолей малого размера (Т1) в группе пациенток с наличием высокоаффинных В-клеток, 28,6% и 14,3% соответственно, с другой стороны индекс Т3 отмечен в одном случае в каждой группе. При оценке сопряженности признаков взаимосвязи между ними не установлено (р>0,05).

При наличии гуморального ответа метастазы в лимфоузлах обнаруживаются несколькореже (64,3% и 85,7%), различия не достоверны. Средний возраст пациенток с наличием высокоаффинных к Leс В-клеток и без таковых не различался (55,7 ± 2,6 и 58,9±5,3 соответственно, р=0,5) Проведение сопоставлений в зависимости от гистологического типа опухоли в данной группе пациенток было невозможным ввиду малого количества случаев инфильтративного долькового рака (2 случая).

Наличие высокоаффинных В-клеток не имело прямой ассоциации с повышенными уровнями антител к Lec (OD > 2,0) в сыворотке крови больных. При наличии высокоаффинных В-клеток высокие уровни антител определялись вдвое реже, чем при их отсутствии (21,4% и 42,9%, р = 0,3).

Сравнение средних уровней иммуноглобулинов в сыворотке крови в зависимости от наличия или отсутствия высокоаффинных В-клеток не выявило достоверных различий: для IgM 204,4±42,5 и 235,6±54,3, p = 0,76; для IgG 210,7±19,3 и 229,3±26,9, р = 0,58; для IgA 176,4±21,8 и 192,7±32,9, р = 0,68.

Наряду с анализом связывания Gal1-3GlcNAc с В-лимфоцитами нами подробно изучен субпопуляционный состав В-клеток. Эти исследования проведены у 30 женщин (21 больная раком молочной железы и 9 – группа сравнения /доноров, 3 пациентки с мастопатией/).

Оценили наличие корреляционных связей между процентом Lec – связывающих В-клеток и их субпопуляций (высокоаффинные, CD5-позитивные) с другими популяциями В-лимфоцитов, различающихся по иммунологическим маркерам.

Общий процент Lec-позитивных В-клеток находился в прямой корреляционной связи с пропорцией CD19+CD5+ лимфоцитов (R=0,404; p=0,037), с процентом В-лимфоцитов, связывающих лактозамин (R=0,402; p=0,031), а также с относительным содержанием CD5+ В-лимфоцитов, связывающих Lec (R=0,973;

p=0,000). Последняя корреляция была наиболее высоко достоверной, что, вероятнее всего, свидетельствует о важной (доминирующей) роли данной субпопуляции (CD5+) лимфоцитов в связывании дисахарида Lec.

В свою очередь, CD5-позитивные Lec –связывающие В-лимфоциты находились в достоверной корреляционной связи с В-клетками, экспрессирующими CD38 (R=0,519; p=0,048), общим процентом CD5-позитивных В-лимфоцитов (R=0,583; p=0,011), зрелых CD5-позитивных CD20+ В-клеток (R=0,581; p=0,011) и IgM-позитивных CD5+ В-лимфоцитов (R=0,532; p=0,023).

Корреляции с пропорцией В-клеток, связывающих лактозамин, в том числе, CD5позитивных В-лимфоцитов не выявлено (p=0,377 и р=0,479 соответственно). Это является дополнительным подтверждением того, что дисахарид-связывающие Влимфоциты действительно являются антиген-специфичными (Lec-специфичными), отсутствует связывание за счет лектинов мембраны В-клеток, в частности, галектинов. Различие между лактозамином и Lec касается только связи между галактозой и глюкозой - Gal1-3GlcNAc в Lec и Gal1-4GlcNAc в лактозамине.

Неожиданным оказалось обнаружение отрицательной корреляционной связи между пропорцией Lec-связывающих CD5+ В-клеток и процентом В-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR (R= -0,559; p=0,02). Рассматривая эту находку в сочетании с высокой корреляцией с CD38-позитивными лимфоцитами, можно предполагать определенную плазмоцитоидную дифференцировку CD5+ Влимфоцитов, специфичных к Lec.

Другим вариантом анализа, предпринятым нами для характеристики Lecспецифичных В-клеток, явилось сравнение средних пропорций субпопуляций Влимфоцитов в переделах группы больных с наличием высокоаффинных Влимфоцитов и без таковых.

Процент Lec+ CD5+ В-клеток в группе больных с высокоаффинными к Lecлимфоцитами в пять раз выше, чем у пациентов с отсутствием этих клеток:

3,3±1,3% и 0,59±0,26%, р = 0,086. Средний процент CD5+ В-клеток в этих группах составил 19,5±4,1% и 26,1±5,4%, р=0,3.

Субпопуляции В-лимфоцитов не были взаимосвязаны с наличием более высоких титров антител к Lec (ОД > 2,0) в сыворотке крови больных раком молочной железы и доноров.

Взаимосвязь Gal1-3GlcNAc (Lec)-связывающих лимфоцитов с концентрацией гликопротеина MUC1 в сыворотке крови больных раком молочной железы.

СА 15.3 – это показатель в условных единицах, который отражает концентрацию муцинов MUC1 в сыворотке крови. Наиболее часто данная маркерная характеристика используется при диагностике и мониторинге эффективности терапии рака молочной железы. В данном тесте молекула MUCопределяется иммуноферментным методом с использованием 2 моноклональных антител (МКА) к белковой части гликопротеина. Оба МКА – 115D8 и DF3 – распознают эпитопы в высокоиммуногенной области тандемных повторов. МКА DF3 направлены против детерминанты TRPAPGS, детерминанта MKA 115Dточно не установлена (в более широком понимании – это один из антигенов мембран жировых глобул).

Как показали предшествующие исследования лаборатории иммунологии гемопоэза, антиген MUC1 (антитела ICO-25) экспрессирован практически в 100% случаев рака молочной железы, причем отмечается как мономорфная, так и мозаичная экспрессия на опухолевых клетках. Однако не все детерминанты молекулы MUC1 представлены на раковых клетках. В норме дисахаридная последовательность Gal1-3GlcNAc, скрыта другими углеводными детерминантами, не является концевой, не доступна для антител и не выявляется как антиген. Нарушение процессов гликозилирования при раке приводит к достаточно частой экспрессии Gal1-3GlcNAc – 56% случаев на начальных стадиях (Шинкарев С.А., 2004) и 72% при раке молочной железы в целом (Rye et al., 1994).

У 21 больной операбельным раком молочной железы на этапе диагностики, до операции оценка сывороточных уровней MUC1 (CA 15.3) проведена в параллели с изучением способности В-клеток и их субпопуляций связывать Lec. У большинства больных уровни онкомаркера были в пределах нормы или ближе к верхней границе нормы, что, по-видимому, обусловлено ранними (операбельными) стадиями рака молочной железы. Вместе с тем, уровни СА 15.3 у этих больных операбельным раком молочной железы при диагностике (7,88 – 107,6; средн. – 23,47) были достоверно более высокими, чем в контрольной группе здоровых женщин (5,86 – 17,19; средн. – 13,07), р = 0,033.

Взаимосвязь между уровнями MUC1 и антител к MUC1 (анти-Lec) в сыворотке крови больных операбельным раком молочной железы.

В анализируемой группе больных изучили наличие антител к Lec в сыворотке крови. Ввиду сложности анализа и перехода к строго количественным концентрационным параметрам данные представлены в виде единиц оптической плотности (ОД) – показателя, который является основой для пересчета в любых ELISA тест-системах и достаточно точно отражает уровни Lec специфичных антител. Данный показатель в анализируемой группе больных находился в диапазоне 0,3 – 2,7 (средн. 1,67 ± 0,59). В контрольной группе здоровых женщин соответствующие цифры были достоверно более высокими 1,76 - 3,17 (средн. 2,6 ± 0,53; р = 0,001).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»