WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ГАДЕЦКАЯ Нина Александровна СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ (14.00.14 - онкология) А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

Работа выполнена в ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН (директор – академик М.И.Давыдов) Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор З.Г.Кадагидзе доктор медицинских наук, профессор В.П.Летягин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.А.Хайленко доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин

Ведущая организация:

Российская медицинская академия последипломного образования

Защита диссертации состоится «31 » января 2007г.

на заседании диссертационного совета (Д.001.17.01) при ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН.

Автореферат разослан « » 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин 2 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Иммунные механизмы противоопухолевой защиты чрезвычайно многообразны. Главными эффекторами, осуществляющими цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток, считаются Т-киллеры (CD8+) и NKклетки. Т-лимфоциты реализуют свое действие через распознавание посредством TCR (Т-клеточного рецептора) опухолеассоциированных пептидов в контексте молекул HLA на мембране злокачественных клеток. Поскольку иммунизация Тклеток осуществляется профессиональными АПК (антигенпрезентирующими клетками), то большое внимание в современных исследованиях уделяется дендритным клеткам и вакцинам на их основе. Реализация цитотоксического действия примированных Т-киллеров возможна только в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих молекулы HLA-I класса. Напротив, действие NK-клеток возможно в отношении клеток с видоизмененными или утраченными молекулами HLA.

Т-клетки и NK-клетки не распознают углеводные детерминанты опухолевых клеток. Вместе с тем, значительная часть опухолеассоциированных антигенов – это углеводные (карбогидратные, отсюда аббревиатура СА) антигены. На их определении во многом основаны диагностика и мониторинг опухолевого процесса по сывороточным маркерам (СА 15-3, СА 125, СА 19-9 и т.д.). Углеводные детерминанты опухолевых клеток эффективно распознаются антителами – то есть эффекторами гуморального иммунитета.

В последние годы гуморальный иммунитет не изучался столь интенсивно, как клеточный иммунитет у больных раком молочной железы. Вместе с тем, накоплен большой фактический материал, указывающий на важную роль Вклеточного звена иммунитета у больных раком молочной железы:

1. В-лимфоциты так же, как и Т-лимфоциты инфильтрируют опухолевую ткань и характеризуются функциональной активностью, проявляющейся в формировании фолликулоподобных структур со светлыми центрами.

2. В-клетки, инфильтрирующие ткань молочной железы, олигоклональны, могут иметь специфичность к опухолеассоциированным антигенам.

3. У части больных раком молочной железы отмечается массивная плазмоклеточная инфильтрация опухоли, иммуноглобулины этих клеток олигоклональны, часть клонов специфична к опухолевым антигенам.

4. В эксперименте внутривенное введение небольшого числа раковых клеток иммунным животным не сопровождается развитием опухоли. Эти клетки эффективно элиминируются антителопосредованными иммунными механизмами.

5. При наличии микрометастазов рака молочной железы в костном мозге выявляются кластеры плазматических клеток.

6. Существуют опухолеассоциированные углеводные детерминанты (выявляемые антителами LU-BCRU-G7), экспрессия которых клетками рака молочной железы ассоциирована с неблагоприятным прогнозом. Учитывая их высокую иммуногенность и возможность индукции специфического антительного ответа, эти молекулы могут явиться потенциальными мишенями противоопухолевой иммунотерапии.

Все выше сказанное дает основание для проведения исследований Вклеточного звена иммунитета на современном уровне с учетом углубленного субпопуляционного состава и клональности В-лимфоцитов, а также плазмоцитов крови и костного мозга, оценки наличия специфических антител к опухолеассоциированным детерминантам в сыворотке крови больных.

Целью настоящей работы явилась характеристика показателей Вклеточного звена иммунитета у больных раком молочной железы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Охарактеризовать субпопуляции и клональность В-клеток периферической крови у больных раком молочной железы.

2. Изучить титры антител к опухолеассоциированному дисахариду Gal 1-3 GclNAc в сыворотке крови больных и здоровых доноров.

3. Изучить особенности связывания опухолеассоциированного дисахарида Gal 1-3 GclNAc В-клетками у больных раком молочной железы.

4. Сопоставить показатели гуморального иммунитета с клиникоморфологическими характеристиками рака молочной железы.

Научная новизна Впервые детально изучены субпопуляции В-лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы. Особенностью иммунофенотипа Влимфоцитов у больных раком молочной железы в сравнении с донорской группой является более высокая экспрессия антигена CD23. В 67% случаев рака молочной железы среди В-лимфоцитов крови присутствуют высокоаффинные к Lec В-клетки, которые включают 2 популяции – CD5+ и CD5-. Выраженный антительный ответ на Lec наблюдается у 30% больных раком молочной железы. Высокие титры антиLec антител находятся в реципрокных взаимоотношениях с сывороточными уровнями опухолеассоциированного антигена СА 15-3 и практически не наблюдаются при высоких концентрациях маркера. У больных с высокими титрами анти-Lec отмечаются повышенные концентрации сывороточного IgM.

Научно-практическая значимость Научно-практическая значимость работы определяется тем, что на основе анализа взаимоотношений Lec-связывающих CD5-позитивных В-лимфоцитов и лактозами-связывающих В-клеток (отсутствие корреляционных связей) может быть разработан алгоритм для более точной оценки содержания анти-Lec специфичных В-клеток в периферической крови. Содержание В-лимфоцитов, специфически связывающих Lec, в случаях наличия высокоаффинной популяции этих клеток достоверно выше, чем количество В-лимфоцитов, связывающих лактозамин.

Результаты работы позволили уточнить роль В-клеточного звена в противоопухолевом иммунитете у больных раком молочной железы. Выделены группы больных с наличием антительного ответа на опухолеассоциированный антиген Gal1-3GclNAc. Случаи с отсутствием гуморальной иммунной реакции на опухолеассоциированный дисахарид могут рассматриваться как группа больных, подлежащих дальнейшему изучению на предмет возможной иммунизации (вакцинации) или адоптивной терапии соответствующими моноклональными антителами.

Апробация диссертации и публикации Основные положения диссертации доложены и обсуждены 6 июля 2007 года на научной конференции лаборатории клинической иммунологии опухолей, лаборатории иммунологии гемопоэза, хирургического отделения опухолей молочных желез, хирургического отделения опухолей женской репродуктивной системы, отделения трансплантации костного мозга и интенсивной химиотерапии НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах, 5 глав, в которых представлены данные литературы и результаты собственных исследований, заключения, выводов, библиографического указателя. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками.

Библиографический указатель включает 4 отечественных и 97 зарубежных источников.

ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования клеточных и антительных показателей гуморального иммунитета проведено у 102 больных раком молочной железы.

Показатели В - клеточного звена иммунитета были проанализированы у первичной больной РМЖ (до лечения).

Средний возраст этих больных составлял 56,8 лет ± 2,4 года. Возрастные показатели колебались в пределах от 35 до 75 лет, медиана составила 56 лет.

Характеристика больных по стадиям заболевания и гистологическим типам опухоли представлена в таблицах 1 и 2.

Контрольная группа включала 9 женщин в возрасте от 27 до 49 лет (здоровых доноров, 3 пациентки с фиброаденомой молочной железы).

У всех пациенток были оценены уровни экспрессии основных активационных антигенов в пределах В-клеток (CD 19+).

Таблица 1.

Характеристика больных раком молочной железы по стадиям заболевания.

Стадия TNM Количество больных Абс. %% I T1N0M0 3 IIa Т1N1M0 4 T2N0M0 IIb T2N1M0 2 IIIa T2N2M0 2 T3N1M0 IIIb T4N0M0 1 T4N2M0 IV T2N0M1 1 Таблица 2. Гистологический тип опухоли Гистологический тип опухоли Число больных Инфильтрирующий протоковый рак Инфильтрирующий дольковый рак Аденогенный рак Цитологическая верификация Характеристика субпопуляций В-лимфоцитов в пределах CD19+ В-клеток проводилась с помощью трехцветной проточной цитометрии.

Общую популяцию лейкоцитов выделяли путем стандартного лизиса эритроцитов. Мононуклеарную фракцию выделяли путем центрифугирования в градиенте фиколл-верографин. Из 5 мл гепаринизированной периферической крови больных РМЖ выделялась фракция мононуклеаров. Для этого кровь, разведенную в 2 раза забуференным физиологическим раствором с добавлением бычьего сывороточного альбумина (ЗФР-БСА), наслаивали на фиккол-верографин и центрифугировали при 1000g 40 мин при комнатной температуре. Мононуклеары собирали пастеровской пипеткой из интерфазы и дважды отмывали ЗФР-БСА.

С выделенными клетками проводили прямую реакцию иммунофлуоресценции (РИФ) в 96-луночном планшете. Для этого в каждую из лунок вносили взвесь клеток в количестве не менее 100 000. Далее в каждую лунку добавлялся коктейль антител в соответствии с панелью и аккуратно ресуспензировался пипеткой. Каждое МКА брали в количестве 10 мкл на лунку, суммарный объем МКА в лунке- 30 мкл. Клетки инкубировали с антителами в течение 30 мин при 4°С. По окончании времени инкубации клетки дважды отмывали от несвязавшихся антител путем центрифугирования в течение 5-7 мин при 1000g. Затем клетки переносили в специальные пластиковые пробирки для счета на проточном цитометре.

Оценка реакции осуществлялась на проточном, 5-параметровом, цитометре FACScan (BD, США). Сбор и анализ клеток осуществлялся в гейте CD19+ клеток, включающим только популяцию В-лимфоцитов. Субпопуляции В-лимфоцитов в пределах CD19+ В-клеток характеризовались на основании коэкспрессии антигенов, представленных в таблице 3. Подсчет абсолютного числа клеток в мкл крови осуществлялся на основании числа лейкоцитов и процентного соотношения лимфоцитов в гемограмме на день исследования.

Таблица 3. Комбинации использованных МКА № пробирки Проба FITC (Fl-1) Проба РЕ (Fl-2) Проба Pe/Cy5 (Fl-3) 1 IgG1 - IgG2 CD45 - CD3 IgG1 IgG1 CD4 CD5 CD20 CD5 CD23 HLA-DR CD6 CD38 CD10 CD7 CD71 CD95 CD8 CDIg Ig 9 IgG CD5 CD10 IgM CD5 CD11 IgA CD5 CD12 Лактозамин FITC CD5 CD13 Lec-FITC CD5 CDНа первом этапе анализа идентифицировали В-клетки и определяли их процентное содержание в пределах лейкоцитов CD45++. Далее в пределах гейта Влимфоцитов определяли экспрессию различных дифференцировочных антигенов на клетках.

Исследование концентрации опухоле-ассоциированного антигена MUC-(СА 15-3) и антител к нему (анти-Lec) в сыворотке крови больных раком молочной железы проведены у 81 больной раком молочной железы на различных стадиях наблюдения и лечения, в том числе, при прогрессировании заболевания и высоких уровнях СА 15.3 в сыворотке крови пациенток. Диагноз во всех случаях был морфологически верифицирован. Продолжительность заболевания на момент исследования составила от 1 мес. до 17 лет: у 15 (18,5%) больных – свыше 5 лет, у 26 (32,1%) – от 2 до 5 лет, у 13 (16%) – от 1 до 2 лет, у 21 (25,9%) – менее года, у (7,4%) продолжительность заболевания не уточнена. У всех этих больных были изучены как концентрация MUC1 (CA 15.3) в сыворотке крови, так и антитела к углеводной (Gal1-3GlcNAc) детерминанте этой молекулы. У 80 больных были определены концентрации иммуноглобулинов 3 классов: М, G, А.

Определение специфических антител к Lec в сыворотке крови.

Планшеты были нагружены полиакриламидными коньюгатами сахаров, мкг/мл в 0,05М Na-карбонатном буфере, рН 9,6, в течение 1 часа при 37С. Затем планшеты были блокированы PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), содержащим 3% BSA (бычий сывороточный альбумин), в течение 1 часа при 37С и трижды отмыты раствором PBS, содержащим 0,1% Tween-(отмывочный буфер). Сыворотку крови больных раком молочной железы (в последовательных двукратных разведениях, начиная с 1:50) добавляли в лунки с конъюгатами сахаров в количестве 100 мкл на лунку и инкубировали в течение часа при 37С, после чего трижды отмывали буферным раствором. На следующем этапе планшеты были инкубированы с антителами к иммуноглобулинам человека, меченными биотином (SouthernBiotec) в разведении 1:5000 в PBS, содержащем 0.3% BSA, в течение 1 часа при 37С и затем отмыты. Цветовая реакция проявлялась 30 минутной инкубацией с 0,1М фосфатом натрия/0,1М кислым цитратным буфером, содержащим 0,04% о-фенилендиамина и 0,03% перекиси водорода. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1М Н2SО4. Абсорбцию регистрировали при длине волны 492 нм на многопараметровом счетчике (Victor, PerkinElmer, US). Каждое исследование дублировалось.

TM Маркер СА 15.3 определяли в сыворотке крови больных раком молочной железы и в донорской группе стандартным иммуноферментным методом (ELISA) с использованием реактивов фирмы Рош.

Уровни иммуноглобулинов классов IgG, IgM, IgA в сыворотке крови больных раком молочной железы определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием тест-систем производства «НПЦ Медицинская иммунология», Россия.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере с использованием программы SPSS и включала корреляционный анализ (коэффициент корреляции R, Пирсона), сравнение средних (критерий Стьюдента, t), анализ сопряженности признаков (Хи-квадрат) и точный критерий Фишера с доверительным интервалом 95%. Использованы как параметрические, так и непараметрические тесты. Различия считались статистически значимыми при р<0,05 (95% точности).

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»