WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

а а б б К РК РК+цАМФ К РК РК+цАМФ E кадгерин E кадгерин snail snail N кадгерин N кадгерин -катенин -катенин Е-кадгерин -катенин Е-кадгерин -катенин tcf-tcf-oct-oct-dab dab РНК РНК Актин Topro-Актин Topro-Рис. 7. Внутриклеточная локализация Рис. 7. Внутриклеточная локализация катенина, актина и E- и N-кадгеринов в катенина, актина и E- и N-кадгеринов в дифференцированных мЭСК методом дифференцированных мЭСК методом иммунофлюоресценции и конфокальной иммунофлюоресценции и конфокальной микроскопии, шкала 15 мкм (а). RT-PCRмикроскопии, шкала 15 мкм (а). RT-PCRанализ экспрессии генов E-кадгерина, snail, анализ экспрессии генов E-кадгерина, snail, Topro-3 N-кадгерин Topro-3 N-кадгерин N-кадгенина, -катенина, Тcf-4, oct-4, dabN-кадгенина, -катенина, Тcf-4, oct-4, dabв недифференцированных и дифференцированных мЭСК (б); К –недифференцированные в недифференцированных и дифференцированных мЭСК (б); К –недифференцированные клетки; РК – дифференцировка 9 сут в присутствии 1 мкМ ретиноевой кислоты, клетки; РК – дифференцировка 9 сут в присутствии 1 мкМ ретиноевой кислоты, РК+цАМФ – дифференцировка 7 сут в присутствии 1 мкМ ретиноевой кислоты, затем РК+цАМФ – дифференцировка 7 сут в присутствии 1 мкМ ретиноевой кислоты, затем сут в среде, содержащей 100 мкМ дибутирил-цАМФ.

сут в среде, содержащей 100 мкМ дибутирил-цАМФ.

мембраны и фактически ко-локализуется с E-кадгерином и -катенином (рис. 6, а).

Обработка клеток ингибитором киназы GSK3 BIO заметно изменяет морфологию клеток:

колонии мЭСК приобретают сферическую форму, однако перемещения -катенина в ядро при этом не происходит (рис. 6, б).

Контроль Контроль BIO BIO 7. Изменение локализации белков межклеточных контактов, Е- и N- кадгеринов и катенина при дифференцировке мЭСК. Постоянное присутствие -катенина в примембранном слое мЭСК позволяет предположить, что изменение его локализации может произойти только в случае изменения статуса клетки. Из литературных источников известно, что в клетках тератокарциномы мыши линии F9, близкой по свойствам к мЭСК, воздействие ретиноевой кислоты приводит к увеличению экспрессии гена dab2, который является регулятором эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) (Prunier, Howe, 2005). Кроме того, мы установили, что в ходе дифференцировки клеток F9 происходит активация транскрипционного фактора AP-1 (рис. 5), который вовлечен в ЭМП в ряде клеточных линий (Eger et al., 2000). Мы решили исследовать, локализацию белков межклеточных контактов E- и N-кадгеринов, -катенина, общую организацию цитоскелета и транскрипцию генов, регулирующих ЭМП при дифференцировке мЭСК в присутствии РК. Дифференцировка мЭСК, индуцированная ретиноевой кислотой (9 сут), изменяет как морфологию клеток, так и организацию цитоскелета, окраска родамин-фаллоидином выявляет актиновые фибриллы (рис. 7, а). При дифференцировке ЭСК наблюдаются изменения внутриклеточной локализации основных компонентов кадгерин/Wnt сигнального каскада. Так, E-кадгерин обнаруживается преимущественно в цитоплазме, а не в примембранном слое, как в недифференцированных мЭСК (рис. 7, а). Кроме того, в области межклеточных контактов появляется N-кадгерин, который не экспрессируется в недифференцированных мЭСК, (рис. 7, а). -катенин в дифференцированных клетках локализуется как на мембране, так и ядре клеток, а также диффузно распределен в цитоплазме. Появление на мембране N-кадгерина вместе с изменением локализации Eкадгерина и -катенина при дифференцировке указывает на то, что дифференцировка мЭСК сопровождается утратой "эпителиального" фенотипа.

8. Экспрессия генов-маркеров эпителиально-мезенхимального перехода при дифференцировке мЭСК. Исследование уровня транскрипции методом RT-PCR показало, что в результате дифференцировки увеличивается содержание мРНК -катенина и tcf-4, который является партнером -катенина по транскрипционной функции. Кроме того, снижается содержание мРНК гена Е-кадгерина и увеличивается содержание мРНК его негативного регулятора - гена snail (Cano et al., 2000) (рис. 7, б). В дифференцированных клетках появляется мРНК генов N-кадгерина и dab-2, которые не детектируются в недифференцированных ЭСК мыши (рис. 7, б). В результате дифференцировки отмечается снижение транскрипции маркера ЭСК oct-4 (рис. 7, б).

Таким образом, ядерная локализация -катенина не является необходимым условием для обеспечения автономной пролиферации недифференцированных мЭСК. Локализация катенина в ядре отмечается в дифференцированных клетках, которые попутно демонстрируют признаки ЭМП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что активность деацетилаз гистонов необходима для обеспечения высокопролиферативного статуса мЭСК.

Ингибиторы HDAC оказывают негативное влияние на пролиферацию мЭСК, влияя на систему регуляции клеточного цикла. Инкубация с ингибиторами HDAC в течение 1 сут приводит к снижению экспрессии позитивных регуляторов клеточного цикла, e2f1, циклина D1, A, фосфатазы cdc25A, c-myc. Известно, что отсутствие длительных блоков клеточного цикла после ДНК-повреждающих воздействий на мЭСК, коррелирует с низким уровнем экспрессии негативного регулятора пролиферации, ингибитора циклин-киназных комплексов, p21Waf1 (Малашичева и др., 2002). В настоящей работе показано, что ингибитор HDAC TSA индуцирует экспрессию гена p21Waf1 на уровне мРНК и белка и усиливает транскрипцию другого ингибитора циклин-киназных комплексов, p57kip2, что коррелирует с индукцией блока клеточного цикла.

Неспособность мЭСК реализовать программу дифференцировки или ускоренного клеточного старения после воздействия ингибиторов HDAC, по всей видимости, связана с тем, что остановка пролиферации, вызванная этими агентами, приводит к запуску программы апоптоза. Система регуляции клеточного цикла мЭСК настроена на постоянное размножение, а постепенное снижение интенсивности деления может происходить при дифференцировке. В ходе дифференцировки происходит репрограммирование хроматина, процесс, при котором происходят многообразные посттрансляционные модификации гистонов. В одной из работ показано, что активность деацетилаз необходима для процесса дифференцировки (Lee et al., 2004). Поэтому обработка ингибиторами HDAC приводит к временному подавлению пролиферации, обратимому при возврате клеток в чистую среду и гибельному при продолжительном воздействии, но не может вызывать полноценную дифференцировку. То, что признаки апоптотической гибели, олигонуклеосомная фрагментация ДНК и активация каспаз отмечаются именно в плавающих, а не в прикрепленных клетках, может означать, что контакты клеток могут обеспечивать сигнал выживания. Известно, что эмбриональные стволовые клетки предпочитают расти колониями.

В качестве модели дифференцировки в настоящей работе использовалось воздействие ретиноевой кислоты, отдельно или в сочетании с дибутирил-цАМФ.

Показано, что в результате дифференцировки принципиально изменяется морфология клеток, экспрессия маркеров эпителиально-мезенхимального перехода, структура цитоскелета и локализация белков межклеточных контактов, E- и N- кадгеринов, катенина. Показано, что в ходе дифференцировки клеток F9 увеличивается транскрипция генов c-fos, c-jun и ДНК-связывающая активность фактора AP-1, который может участвовать в ЭМП. Воздействие TSA, хотя и вызывает морфологические изменения клеток, а кроме того индуцирует транскрипцию гена c-fos, неспособно вызвать таких признаков эпителиально-мезенхимального перехода как экспрессию dab2, N-кадгерина и появление актиновых стресс-фибрилл. В настоящей работе показано, что в недифференцированных мЭСК, обладающих чертами трансформированного фенотипа и высоким пролиферативным потенциалом, -катенин локализуется исключительно у мембран и его локализация не меняется даже после активации Wnt-пути ингибитором киназы GSK3, BIO. Ядерная локализация -катенина в клетках, обработанных ретиноевой кислотой, свидетельствует о том, что активация Wnt-пути происходит при дифференцировке мЭСК.

ВЫВОДЫ 1. Ингибиторы деацетилаз гистонов вызывают подавление пролиферации мЭСК, индуцируя блок клеточного цикла и последующий запуск апоптотической гибели.

2. Подавление пролиферации мЭСК после воздействия ингибиторов деацетилаз гистонов сопровождается снижением уровня мРНК таких позитивных регуляторов клеточного цикла как циклин D1, циклин A, фосфатаза cdc25A, c-myc, e2f1 и усилением экспрессии негативных регуляторов – p21Waf1 и p57Kip2.

3. Воздействие ингибиторов деацетилаз гистонов вызывает появление некоторых признаков дифференцированных клеток, но не приводит к полноценной дифференцировке или к индукции ускоренного клеточного старения.

4. В недифференцированных быстроделящихся мЭСК -катенин локализован в области клеточных мембран и не детектируется в ядрах клеток.

5. Установлено, что перемещение -катенина в ядро, появление на мембране Nкадгерина и перераспределение E-кадгерина из мембран в цитоплазму наблюдается при дифференцировке клеток, вызванной ретиноевой кислотой.

6. Показано, что дифференцировка мЭСК, индуцированная ретиноевой кислотой сопровождается изменением транскрипции генов, характерным для эпителиальномезенхимального перехода.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Лянгузова М. С., Чуйкин И. А., Поспелов В.А.. Необходимость активации PI3киназы для пролиферации клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9.

Цитология. 2004. Т 46. № 1. С. 26-2. Чуйкин И. А., Лянгузова М. С., Поспелов В. А. Транскрипция гена c-fos и ДНКсвязывающая активность транскрипционного фактора AP-1 увеличиваются в результате дифференцировки клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9.

Цитология. 2004. Т. 46. № 12. С. 1080-3. Лянгузова М.С., Чуйкин И.А., Поспелов В.А. Фармакологические ингибиторы киназы PI3K вортманнин и LY294002 оказывают различное действие на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток мыши. 2006. Цитология. Т. 48. № 7. С. 560-4. Чуйкин И. А., Лянгузова М. С., Поспелов В. А. Механизмы антипролиферативного действия ингибиторов деацетилаз гистонов на эмбриональные стволовые клетки мыши. Цитология. 2006. Т 48. № 8. С. 612-5. Чуйкин И.А., Поспелов В.А.. Анализ ДНК-связывающей активности фактора АР-и транскрипции генов раннего ответа c-fos и c-jun в клетках эмбриональной карциномы мыши линии F9. Всероссийский симпозиум 1-й съезд общества клеточной биологии. Санкт-Петербург, 14-16 октября 2003. Стендовое сообщение.

Цитология. 2003. Т. 45. № 9. С. 6. Tchouikine I.A., Pospelov V.A. Regulation of AP-1 transcription factor through different signaling pathways in mouse F9 teratocarcinoma cells. Oral presentation. 14th European Student Conference at Charite, Берлин, Германия. 4-9 ноября 2003.

Abstract

Book. P.

7. Чуйкин И.А., Лянгузова М.С., Поспелов В.А.. Ингибитор PI3-киназы LYвызывает обратимое подавление пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши линии IOUD-2. Международный симпозиум по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия». Санкт-Петербург, 25-октября 2004. Стендовое сообщение. Цитология. Т. 46. С. 8. Chuykin I.A., Liangouzova M.S., Pospelov V.A. PI3-kinase inhibitor LYsupresses proliferation of murine embryonic stem cells but does not affect STAT- phosphorylation. 3rd Annual Meeting of the International Society for Stem Cell Research.

San-Francisco, June 23-25, 2005. Стендовое сообщение. Abstract book. P. 9. Чуйкин И.А., Лянгузова М.С., Поспелов В.А.. Механизмы антипролиферативного действия ингибитора HDAC на эмбриональные стволовые клетки мыши.

Конференция «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты». Москва 1718 ноября 2005 г. Устный доклад. Программа и тезисы докладов. С. 73-СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абрамова М. В., Светликова С. Б., Аксенов Н. Д., Поспелова Т. В., Поспелов В. А.

Игибитор деацетилаз гистонов останавливает пролиферацию клеток, трансформированных онкогенами Е1А и cHA-RAS. Цитология. 2003. Т. 45. № 11. С.

1100-2. Лянгузова М. С., Чуйкин И. А., Поспелов В.А.. Необходимость активации PI3киназы для пролиферации клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9.

Цитология. 2004. Т 46. № 1. С. 26-3. Лянгузова М.С., Чуйкин И.А., Поспелов В.А. Фармакологические ингибиторы киназы PI3K вортманнин и LY294002 оказывают различное действие на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток мыши. 2006. Цитология. Т. 48. № 7. С. 560-4. Малашичева А.Б., Кислякова Т.В., Саватьер П., Поспелов В.А. Эмбриональные стволовые клетки не вступают в арест клеточного цикла под воздействием ДНКповреждающих факторов. Цитология. 2002. Т. 44. № 7. С. 643-5. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофеюк А.В., Кузнецова И.М. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология. 1998. Т. 40. № 8/9. С. 806-6. Чуйкин И. А., Лянгузова М. С., Поспелов В. А. Механизмы антипролиферативного действия ингибиторов деацетилаз гистонов на эмбриональные стволовые клетки мыши. Цитология. 2006. Т 48. № 8. С. 612-7. Чуйкин И. А., Лянгузова М. С., Поспелов В. А. Транскрипция гена c-fos и ДНКсвязывающая активность транскрипционного фактора AP-1 увеличиваются в результате дифференцировки клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9.

Цитология. 2004. Т. 46. № 12. 1080-8. Araki K., Nakajima Y., Eto K., Ikeda M. 2003. Distinct recruitment of E2F family members to specific E2F-binding sites mediates activation and repression of the E2Fpromoter. Oncogene. V 22. № 7. 7632–9. Bienz M. -Catenin: A Pivot between Cell Adhesion and Wnt Signalling. Curr Biol. 2004.

V. 15. № 2. P. 64-10. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of mocrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Annal Biochem. 1976. V. 72.

248-11. Brook F.A., Gardner R.L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. PNAS. 1997. V. 94. № 11. P. 5709–12. Burgess A.J., Pavey S., Warrener R., Hunter L.J., Piva T.J., Musgrove E.A., Saunders N., Parsons P.G., Gabrielli B.G. Up-regulation of p21(WAF1/CIP1) by histone deacetylase inhibitors reduces their cytotoxicity. Mol Pharmacol. 2001. V. 60. № 4. P. 828- 13. Cano A., Perez-Moreno M.A., Rodrigo I., Locascio A., Blanco M.J., del Barrio M.G., Portillo F., Nieto MA. The transcription factor Snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2000. V. 2. № 2. P. 76–14. Cartwright P., McLean C., Sheppard A., Rivett D., Jones K., Dalton S. LIF/STATcontrols ES cell self-renewal and pluripotency by a Myc-dependent mechanism. 2005.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»