WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

3. Влияние ингибитора деацетилаз гистонов на экспрессию позитивных и негативных регуляторов клеточного цикла. Поскольку активность ацетилаз и деацетилаз гистонов в первую очередь связана с регуляцией транскрипции, мы исследовали влияние TSA на уровень экспрессии генов, кодирующих регуляторы клеточного цикла после 1 сут воздействия, временной точке, в которой отмечается подавление пролиферации, но отсутствует массовый апоптоз. На рис. 3, видно, что после воздействия TSA снижается содержание транскриптов для позитивных регуляторов клеточного цикла e2f1, циклина D1, циклина A, с-myc и cdc25A на уровне мРНК. Снижение содержания белка Oct-4, циклина D1 и циклина A показано c помощью вестерн-блоттинга (рис. 4, б). Данные о негативном влиянии ингибиторов HDAC на экспрессию генов e2f1, циклин А, cdc25A могут объясняться тем, что воздействие ингибиторов HDAC может приводить к снижению содержания гиперфосфорилированной формы белка Rb в фибробластах человека, и, следовательно, подавлению активации транскрипционного фактора E2F. Такой эффект ингибиторов HDAC был показан на фибробластах человека (Ogryzko et al., 1996). В наших экспериментах показано, что воздействие TSA приводит к снижению транскрипции e2f1.

Падение транскрипции e2f1 и снижение активности транскрипционных факторов E2F может объяснять подавление транскрипции генов циклина A2, cdc25A (рис. 3), содержащих в промоторах сайты связывания E2F (Araki et al., 2003; Stevens, La Thangue, 2003).

Транскрипционный фактор c-Myc стимулирует прохождение по клеточному циклу независимо от пути Rb/E2F. Недавние исследования показали, что в мЭСК ген c-myc является мишенью STAT3 и играет важную роль в сохранении плюрипотентности (Cartwright et al., 2005). Согласно нашим данным, TSA вызывает подавление транскрипции гена c-myc (рис. 3, а). Ранее на линии клеток лейкемии CEM-CM3 было показано, что ингибиторы HDAC вызывают увеличение транскрипции негативных регуляторов функции c-Myc, MXI1, Mad, MLX, и кроме того, подавляют транскрипцию самого гена c-myc (Peart et al., 2005).

Известно, что ферменты HDAC оказывают негативное влияние на транскрипцию гена ингибитора циклин-киназных комплексов p21Waf1, и что после воздействия ингибиторов HDAC происходит его экспрессия по р53-независимому механизму (Xiao et al., 1997; Burgess et al., 2000; Richon et al., 2001; Gui et al., 2004). Количество белка p21Waf1 в мЭСК мало, в результате чего не происходит реализации блоков клеточного цикла при действии генотоксических и стресс-факторов (Малашичева и др., 2002). Результаты нашей работы показывают, что TSA вызывает в мЭСК активацию экспрессии гена p21Waf1 на уровне мРНК и белка (рис. 3, а, б). Впервые показано, что воздействие TSA вызывает индукцию транскрипции ингибитора циклин-киназных комплексов p57kip2 (рис 3, а).

Данные RT-PCR и Вестерн-блотинга показывают тенденцию к снижению экспрессии третьего члена семейства ингибиторов циклин-киназных комплексов p27kip1 на уровне мРНК, и белка (рис. 3). Данных о том, что ген p27kip1 является геном, индуцируемом ингибиторами HDAC, как, например, ген p21Waf1, нет. Исследование профиля транскрипции генов после воздействия ингибиторов HDAC на клеточную линию аденокарциномы поджелудочной железы показывает снижение транскрипции p27kip(Moore et al., 2004), что согласуется с нашими данными. Таким образом, способность ингибиторов HDAC вызывать блок клеточного цикла коррелирует с активацией экспрессии p21Waf1 и p57Кip2, но не p27kip1 (рис. 3, Чуйкин и др., 2006; Лянгузова и др., 2006).

[TSA] [NaBut] [TSA] [NaBut] TSA NaBut TSA NaBut нМ мМ нМ мМ а 150 нМ 10 мМ - 1 сут - 2 сут в а 150 нМ 10 мМ - 1 сут - 2 сут в б б - 25 75 150 5 10 M - 25 75 150 5 10 M 100 % 100 % 0 25 75 150 200 0 25 75150 0 25 75 150 200 0 25 75150 - + - + - + - + 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 [TSA], нМ [TSA], нМ Рис. 2. Обработка ингибиторами HDAC приводит к апоптотической гибели мЭСК; а – Рис. 2. Обработка ингибиторами HDAC приводит к апоптотической гибели мЭСК; а – нуклеосомная фрагментация ДНК в мЭСК через 2 сут действия TSA и NaBut, а также в нуклеосомная фрагментация ДНК в мЭСК через 2 сут действия TSA и NaBut, а также в прикрепленных (-) иоткрепившихся (+) клетках; б –MTT-тест через 1 и 2 сут воздействия прикрепленных (-) иоткрепившихся (+) клетках; б –MTT-тест через 1 и 2 сут воздействия на мЭСК TSA; в – анализ активности каспазы 3 в клеточных экстрактах с применением на мЭСК TSA; в – анализ активности каспазы 3 в клеточных экстрактах с применением флюоресцентного субстрата AcDEVD-AMC; по оси ординат – относительные единицы флюоресцентного субстрата AcDEVD-AMC; по оси ординат – относительные единицы флюоресценции, 1 – Контроль, 2 –1 сут обработки TSA, 3 –2 сут обработки TSA, 4 –2 сут флюоресценции, 1 – Контроль, 2 –1 сут обработки TSA, 3 –2 сут обработки TSA, 4 –2 сут обработки TSA, только прикрепленные клетки, 5 –2 сут обработки TSA, в реакцию обработки TSA, только прикрепленные клетки, 5 –2 сут обработки TSA, в реакцию добавлен ингибитор каспаз ZVAD; TSA использовался в концентрации 150 нМ, кроме добавлен ингибитор каспаз ZVAD; TSA использовался в концентрации 150 нМ, кроме пробы 4 экстракты получены из прикрепленных + открепленных клеток.

пробы 4 экстракты получены из прикрепленных + открепленных клеток.

а б а б TSA 150 нМ - + TSA 150 нМ - + oct-oct-TSA 150 нМ - + TSA 150 нМ - + e2fe2fOct-Oct-циклин Dциклин DЦиклин DЦиклин Dциклин E циклин E циклин A циклин A Циклин A Циклин A c-myc c-myc cdc25A cdc25A TSA TSA 0 2 6 9 0 2 6 9 150 нМ (ч) 150 нМ (ч) p27kip p27kip p21Waf p21Waf p27kip p27kip p57kip p57kip p21Waf p21Waf РНК РНК Рис. 3. Влияние TSA на экспрессию генов, кодирующих регуляторы клеточного цикла; а – Рис. 3. Влияние TSA на экспрессию генов, кодирующих регуляторы клеточного цикла; а – RT-PCR-анализ транскрипции генов oct-4, позитивных (циклин D1, e2f1, циклин E, циклин RT-PCR-анализ транскрипции генов oct-4, позитивных (циклин D1, e2f1, циклин E, циклин A, cdc25A, c-myc) и негативных (p21Waf1, p27kip1, p57kip2) регуляторов клеточного цикла;

A, cdc25A, c-myc) и негативных (p21Waf1, p27kip1, p57kip2) регуляторов клеточного цикла;

денатурирующий электрофорез РНК приведен в качестве контроля нагрузки; б – вестернденатурирующий электрофорез РНК приведен в качестве контроля нагрузки; б – вестернблот-анализ уровня экспрессии белков циклина D1, циклина A, p21Waf1, p27kip1.

блот-анализ уровня экспрессии белков циклина D1, циклина A, p21Waf1, p27kip1.

4. Обработка ингибиторами деацетилаз гистонов не вызывает активации маркера дифференцированных и стареющих клеток SA-Gal. В некоторых клеточных линиях, например в фибробластах человека, ингибиторы HDAC вызывают процесс ускоренного клеточного старения (Ogryzko et al., 1996). Способность подвергаться старению зависит от типа клетки, ее способности избежать запуска апоптоза и реализовать длительный блок клеточного цикла. Поскольку TSA вызывает снижение количества Oct-4, а также Контроль 25 нМ TSA, 5 сут Контроль 25 нМ TSA, 5 сут Рис. 4. Выявление Рис. 4. Выявление активности SAGal активности SAGal в мЭСК через 5 сут в мЭСК через 5 сут обработки 25 нМ обработки 25 нМ TSA и через 1 сут TSA и через 1 сут обработки 150 нМ обработки 150 нМ TSA; позитивный TSA; позитивный 150 нМ TSA, 1 сут Дифференцированные клетки 150 нМ TSA, 1 сут Дифференцированные клетки контроль контроль дифференцированн дифференцированн ые мЭСК, Контроль ые мЭСК, Контроль – мЭСК; фото в – мЭСК; фото в проходящем свете проходящем свете (объектив 40х).

(объектив 40х).

a б a б TGAGTCA TTACCTCA TGAGTCA TTACCTCA TGAGTCA TTACCTCA Сайт связывания Сайт связывания Сайт связывания Сol-AP-1 Jun2-АР-Сol-AP-1 Jun2-АР-Сol-AP-1 Jun2-АР-нд диф4диф6 нд диф4дифнд диф4диф6 нд диф4дифнд диф4диф6 нд диф4дифСпецифическое Специфическое Специфическое - + NaBut - + NaBut связывание связывание связывание c-fos c-fos gapdh gapdh - + TSA - + TSA Свободная Свободная Свободная проба проба проба c-fos c-fos gapdh gapdh 1 2 3 1 2 1 2 3 1 2 1 2 3 1 2 Рис. 5. a - ретардация меченых олигонуклеотидов в ПААГ с белками ядерных экстрактов, Рис. 5. a - ретардация меченых олигонуклеотидов в ПААГ с белками ядерных экстрактов, полученных из клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9 на разных стадиях полученных из клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9 на разных стадиях дифференцировки; нд - недифференцированные клетки, диф 4 - четверо суток после дифференцировки; нд - недифференцированные клетки, диф 4 - четверо суток после обработки индукторами (РК), диф 6 шесть суток после обработки индукторами (РК+дбобработки индукторами (РК), диф 6 шесть суток после обработки индукторами (РК+дбцАМФ); б - RT-PCR-анализ транскрипции гена c-fos в недифференцированных клетках цАМФ); б - RT-PCR-анализ транскрипции гена c-fos в недифференцированных клетках линии F9 после воздействия ингибиторов HDAC TSA и NaBut, ген gapdh использован для линии F9 после воздействия ингибиторов HDAC TSA и NaBut, ген gapdh использован для контроля нагрузки кДНК в реакции PCR.

контроля нагрузки кДНК в реакции PCR.

остановку пролиферации, накопление негативного регулятора клеточного цикла p21Waf1 и подавление экспрессии генов, стимулирующих пролиферацию, (рис. 3), мы решили проверить, вызывают ли ингибиторы HDAC клеточное старение мЭСК. Для этого применялись разные сроки воздействия и разные концентрации TSA. Была взята точка сут воздействия 150 нМ TSA. Для возможности исследовать более длительное воздействие брали низкую концентрацию, 25 нМ TSA, и изучали результат действия ингибитора в течение 2-х и 5 сут. Тест на активность SA-Gal, не показал в клетках, обработанных TSA, специфического окрашивания, характерного для дифференцированных и стареющих клеток при всех использованных условиях (рис. 4, Чуйкин и др., 2006). Отсутствие активности SA-Gal, невозможность подавить апоптоз и реализовать длительный блок клеточного цикла после воздействия ингибиторов HDAC, характерны для мЭСК и, по всей видимости, свидетельствуют о том, что система регуляции клеточного цикла настроена на постоянную пролиферацию мЭСК и подавление запуска апоптоза.

5. Активность транскрипционного фактора AP-1 увеличивается при дифференцировке клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9 (Чуйкин и др., 2004; Лянгузова и др., 2004). Клетки F9 обладают близким сходством с мЭСК, сохраняя ограниченный потенциал к дифференцировке при воздействии индукторов. Ретиноевая кислота (РК) и дибутирил-цАМФ (дб-цАМФ) вызывают их дифференцировку в направлении париетальной эндодермы (Strickland, 1981). Мы решили исследовать, как меняется активность фактора АР-1 при дифференцировке клеток F9. Для выявления ДНКсвязывающей активности транскрипционных комплексов АР-1 использовали метод ретардации в ПААГ олигонуклеотидов меченых [-32Р]-АТФ. В качестве олигонуклеотидных проб использовали последовательности Col-AP-1 и Jun2-АР-1 из промоторов генов коллагеназы (5’-AGCATGAGTCAGCC-3’) и c-jun (5‘AGCTAGCATTACCTCATCCC-3‘) соответственно. В экстрактах недифференцированных клеток мы выявили низкую интенсивность сигнала на рентгенограмме, соответствующую ДНК-белковым комплексам с обеими мечеными пробами (рис. 5, а, дорожки 1).

Интенсивность сигнала сильно возрастала после четырех и шести сут обработки индукторами, РК и дб-цАМФ (рис. 5, а дорожки 2, 3). Мы также выяснили, что транскрипция гена c-fos, кодирующего один из белков, входящих в состав транскрипционного фактора AP-1, в недифференцированных клетках F9 находится под негативной регуляцией деацетилаз гистонов. Воздействие ингибиторов HDAC TSA и NaBut приводит к индукции транскрипции гена c-fos (рис. 5, б).

6. Недифференцированные быстроделящиеся мЭСК не содержат -катенин в ядре.

Сигнальные пути, обеспечивающие высокопролиферативный статус мЭСК, в настоящее время изучены недостаточно. Недавно появились данные о том, что активация Wnt/катенинового пути способствует поддержанию плюрипотентного состояния мЭСК даже в отсутствии фактора LIF (Sato et al., 2004). Поскольку ядерная локализация -катенина отмечается в быстроделящихся клетках-предшественниках тканей (Reya et al., 2003; He et al., 2004) и в различных типах опухолевых клеток (Fukuchi et al., 1998; Sparks et al., 1998;

Koch et al., 1999), большой интерес представляло исследовать внутриклеточную локализацию -катенина в мЭСК. Методом иммунофлюоресценции показано, что в недифференцированных мЭСК -катенин имеет примембранную локализацию и не детектируется в ядре (рис. 6, а). Мы использовали окраску родамин-фаллоидином, чтобы увидеть расположение актина в мЭСК и не обнаружили актиновых фибрилл в цитоплазме клетки, так как актин преимущественно располагается в кортикальном слое возле а а б б Е-кадгерин Актин N-кадгерин Е-кадгерин Актин N-кадгерин -катенин Topro--катенин Topro--катенин Topro-3 Негативный контроль -катенин Topro-3 Негативный контроль Рис. 6. Внутриклеточная локализация -катенина, актина и E- и N-кадгеринов в мЭСК (а) и Рис. 6. Внутриклеточная локализация -катенина, актина и E- и N-кадгеринов в мЭСК (а) и локализация -катенина до и после обработки мЭСК 5 мкМ BIO (б) методом локализация -катенина до и после обработки мЭСК 5 мкМ BIO (б) методом иммунофлюоресции и конфокальной микроскопии; а – шкала 11 мкм, б – шкала 30 мкм;

иммунофлюоресции и конфокальной микроскопии; а – шкала 11 мкм, б – шкала 30 мкм;

фаллоидин – окраска на актин с помощью родамин-фаллоидина, Topro-3 – окрашивание ядер фаллоидин – окраска на актин с помощью родамин-фаллоидина, Topro-3 – окрашивание ядер с помощью красителя Topro-3, негативный контроль - контроль без первых антител.

с помощью красителя Topro-3, негативный контроль - контроль без первых антител.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»