WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

ЧУЙКИН Илья Александрович МЕХАНИЗМЫ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНГИБИТОРОВ ДЕАЦЕТИЛАЗ ГИСТОНОВ НА ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ МЫШИ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Пинаев Георгий Петрович Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук, профессор Дондуа Арчил Карпезович Санкт-Петербургский Государственный университет

Ведущая организация: ГУ НИИ Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится «27» октября 2006 года в 13 час на заседании Диссертационного совета Д. 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, СанктПетербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан 26 сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.В. Каминская 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время, изучение механизмов пролиферации эмбриональных стволовых клеток представляет важное направление клеточной и молекулярной биологии.

Эмбриональные стволовые клетки мыши (мЭСК) являются ценным объектом для изучения процессов раннего эмбрионального развития благодаря своей доступности и относительной простоте культивирования. Сохранение плюрипотентности в течение многих пассажей позволяет создавать химерные особи мышей и благодаря этому изучать функции генов in vivo. Способность к дифференцировке в различные типы клеток in vitro делает эмбриональные стволовые клетки перспективным объектом для разработки подходов направленной дифференцировки и их будущего использования в качестве материала для терапии поврежденных тканей (Brook, Gardner, 1997; Smith, 2001). Для создания и применения таких методов необходимо детально исследовать механизмы, обеспечивающие сохранение недифференцированного состояния эмбриональных стволовых клеток. Ряд морфологических и молекулярных признаков сближает недифференцированные мЭСК с трансформированными клетками. Можно отметить следующие признаки: высокий пролиферативный потенциал мЭСК и независимость пролиферации от экзогенных ростовых факторов (Schratt et al., 2001). Отличительной особенностью мЭСК является также их неспособность к длительной блокам G1/S или G2/M клеточного цикла при действии ДНК-повреждающих агентов и стресс-факторов, что говорит об отсутствии полноценных сверочных точек клеточного цикла (Малашичева и др., 2002). По-видимому, как в опухолевых клетках, так и в мЭСК постоянно функционируют эндогенные митогенные сигналы, которые стимулируют продвижение мЭСК по клеточному циклу.

Активность деацетилаз гистонов (HDAC) может быть связана как с поддержанием автономной пролиферации, так и трансформированного фенотипа, поскольку репрессия некоторых негативных регуляторов пролиферации и индукторов дифференцировки происходит с участием этих ферментов (Dokmanovic, Marks, 2005). Есть данные, позволяющие предполагать, что активность HDAC необходима для пролиферации ранних эмбриональных клеток. Изучение эмбрионов мышей, нокаутных по HDAC1, показало снижение числа клеток внутренней клеточной массы и раннюю летальность зародышей.

Кроме того, мЭСК, полученные из таких эмбрионов, имеют более низкую скорость прироста популяции (Lagger et al., 2002). Есть данные, показывающие, что активность HDAC необходима для дифференцировки мЭСК (Lee et al., 2004). В настоящее время, ингибиторы HDAC рассматриваются как перспективные противоопухолевые агенты и активно используются в научных исследованиях. В зависимости от тканевой принадлежности и функционального состояния, различные клетки обладают разной чувствительностью к ингибиторам HDAC, реализуя как длительные блоки клеточного цикла с признаками дифференцировки и клеточного старения, так и кратковременные остановки с последующим запуском программы апоптоза. Изучение эффекта ингибиторов HDAC на мЭСК является актуальной и интересной задачей, поскольку это позволит получить информацию об особенностях системы регуляции клеточного цикла в этих клетках.

Механизмы автономной пролиферации мЭСК пока изучены недостаточно, в частности, нет четких данных о сигнальных путях, вовлеченных в этот процесс. Недавно было показано, что активация Wnt/-катенинового пути способствует поддержанию плюрипотентного состояния мЭСК даже в отсутствии фактора LIF (Sato et al., 2004). Как известно, -катенин выполняет в клетке разнообразные функции в разных компартментах:

вместе с Е-кадгерином он участвует в образовании межклеточных контактов, в составе комплексов с транскрипционными факторами семейства LEF/TCF -катенин функционирует в качестве ко-активатора транскрипции генов в ядре, а в составе цитоплазматических комплексов с белками CKI, GSK3, APC и аксином -катенин фосфорилируется для последующей протеасомной деградации (Bienz, 2004). Поскольку катенин-зависимая транскрипция, отмечается в быстроделящихся клеткахпредшественниках тканей (He et al., 2004; Reya et al., 2003) и в различных типах опухолевых клеток (Fukuchi et al., 1998; Sparks et al., 1998; Koch et al., 1999), а экспрессия Е-кадгерина может модулироваться на уровне структуры хроматина (Peinado et al., 2004), большое интерес представляет исследовать внутриклеточную локализацию -катенина в недифференцированных быстроделящихся мЭСК и при их дифференцировке. Учитывая, что сигнальная функция -катенина важна в ходе гаструляции при реализации эпителиально-мезенхимального перехода (Kemler et al., 2004), важно выяснить, как меняется экспрессия генов, характерных для эпителиальных и мезенхимных клеток при дифференцировке мЭСК.

Цели и задачи исследования.

Целями данного исследования являлось:

1. Изучение зависимых от структуры хроматина механизмов регуляции клеточного цикла и пролиферации мЭСК in vitro с использованием ингибиторов гистондеацетилазной активности.

2. Исследование внутриклеточной локализации белков межклеточной адгезии и изменения активности Wnt-сигнального пути при действии ингибиторов HDAC и при дифференцировке мЭСК.

Для реализации этих целей были поставлены следующие задачи:

а) исследовать эффект ингибиторов HDAC на скорость прироста популяции и параметры клеточного цикла недифференцированных мЭСК;

б) оценить уровень экспрессии генов, кодирующих позитивные и негативные регуляторы клеточного цикла, после обработки мЭСК ингибиторами HDAC;

в) исследовать влияние ингибиторов HDAC на жизнеспособность мЭСК и индукцию апоптотической гибели;

г) выяснить, приводит ли обработка ингибиторами HDAC к индукции преждевременного клеточного старения или к дифференцировке клеток;

д) исследовать внутриклеточную локализацию -катенина в недифференцированных мЭСК при обработке ингибиторами HDAC и при активации Wnt-сигнального пути ингибитором киназы GSK3 6-Bromoindirubin-3’-oxime (BIO);

е) исследовать экспрессию генов-маркеров эпителиально-мезенхимального перехода при дифференцировке мЭСК, а также другие признаки этого процесса: особенности организации актинового цитоскелета и внутриклеточную локализацию белков межклеточных контактов -катенина, E-кадгерина и N-кадгерина.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Ингибиторы HDAC подавляют пролиферацию эмбриональных стволовых клеток мыши, вызывают остановку в фазе G1/S или G2/M клеточного цикла и последующую апоптотическую гибель.

2. Эмбриональные стволовые клетки мыши не способны реализовать долговременные блоки клеточного цикла при действии ингибиторов HDAC, которые сопровождались бы признаками ускоренного старения или дифференцировки.

3. Для быстроделящихся эмбриональных стволовых клеток мыши не характерна ядерная локализация -катенина.

4. Дифференцировка мЭСК, индуцированная ретиноевой кислотой (RA), сопровождается активацией Wnt-сигнального пути и индукцией эпителиальномезенхимального перехода.

Научная новизна работы.

Впервые показано, что ингибиторы деацетилаз гистонов (HDAC) оказывают негативное влияние на пролиферацию мЭСК, вызывают блок клеточного цикла и снижают транскрипцию позитивных регуляторов клеточного цикла, таких как циклин D1 и циклин А, фосфатаза cdc25A, c-myc, и e2f1 и индуцируют транскрипцию негативных регуляторов клеточного цикла p21waf1 и p57kip2. Показано, что остановка клеточного цикла мЭСК, вызванная ингибиторами HDAC, не сопровождается признаками ускоренного клеточного старения и дифференцировки, но приводит к массовой апоптотической гибели. Несмотря на сходство мЭСК с трансформированными клетками (опухолей), многие из которых демонстрируют дерегуляцию Wnt-сигнального пути, для быстроделящихся недифференцированных мЭСК не характерна внутриядерная локализация -катенина, который имеет в этих клетках исключительно мембранную локализацию Напротив, при дифференцировке мЭСК ретиноевой кислотой наблюдается релокализация -катенина в ядро, индукция экспрессии генов-маркеров эпителиально-мезенхимального перехода и замена Е-кадгерина на мембране на N-кадгерин.

Теоретическое и практическое значение работы Результаты данной работы могут быть использованы для дальнейшего углубленного изучения механизмов регуляции клеточного цикла ранних эмбриональных клеток; дают важную информацию о сигнальных процессах, необходимых для самообновления мЭСК.

Данные работы могут быть использованы при исследовании процессов, происходящих при дифференцировке мЭСК. Кроме этого, результаты работы служат иллюстративным практическим материалом в учебном спецкурсе по регуляции клеточного цикла и биологии опухолевых и стволовых клеток, читаемом на кафедре биохимии биологопочвенного факультета СПбГУ.

Апробация работы По теме диссертации опубликовано 4 статьи. Основные положения доложены и обсуждены на Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» (СанктПетербург, 2003, 2004), на международной студенческой конференции (Берлин, Германия, 2003), на 3-й международной конференции международного общества по изучению стволовых клеток (Сан-Франциско, США, 2005), на Всероссийской конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2005).

Финансовая поддержка работы Работа была поддержана грантами РФФИ (06-04-49058), CRDF (RB1-2511-ST-03) и Программой РАН «Молекулярная и клеточная биология», Научная школа (Госконтракт:

02.445.11.7337), Договор НОЦ РИ-16.0/0010-3. Работа была выполнена с использованием оборудования ЦКП «Материаловедение и диагностика в передовых технологиях».

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и списка сокращений. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста и иллюстрирована 1 таблицей, рисунками и 5 схемами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Культивирование клеток. мЭСК линии IOUD2 были любезно предоставлены P.

Savatier (Лаборатория клеточной и молекулярной биологии, Лион, Франция). Клетки культивировали в 7.5 % СO2 при 37 С на пластиковых чашках Петри (Corning, США), покрытых 0.2 % раствором желатина (Sigma, США) в среде DMEM (Gibco BRL, США), содержащей 40 мкг/мл гентамицина, 10 % сыворотки (PAA, Австрия), 25 ед/мл фактора LIF (Sigma, США). Клетки тератокарциномы мыши линии F9, полученные из Банка клеточных культур Института цитологии РАН, культивировали в среде DMEM (ICN, США) с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки и 40 мкг/мл гентамицина на пластиковых чашках Петри (Sarstedt, Германия), покрытых 0.2 % раствором желатина (Sigma). Дифференцировку индуцировали, рассевая клетки в среде, не содержащей фактора LIF, через 1 сут культивирования добавляли 1 мкМ ретиноевой кислоты (All-trans retinoic acid, Sigma, США), еще через 7 сут добавляли 100 мкМ дибутирил-цАМФ (Sigma, США) и культивировали еще 2 сут, или культивировали 9 сут только в присутствии ретиноевой кислоты (Strickland, 1981). Для позитивного контроля на активность маркера старения SА-Gal клетки дифференцировали в присутствии 1 мкМ ретиноевой кислоты сначала в суспензии 5 сут, затем в адгезионной культуре в течение 3-х недель. В качестве ингибиторов деацетилаз гистонов (HDAC) использовали: трихостатин А (TSA) и бутират натрия (NaBut), обладающих различной структурой и подавляющих активность ферментов HDAC первого класса (Sigma, США). TSA использовался в большинстве экспериментов, так как этот агент ингибирует ферменты HDAC c большей специфичностью по сравнению с NaBut, действуя в наномолярных концентрациях. В качестве ингибитора киназы GSK3 в среду добавляли BIO (6-Bromoindirubin-3’-oxime, Calbiochem, США) в концентрации мкМ, как рекомендовано другими авторами (Sato et al., 2004).

Для изучения динамики роста популяции клетки сеяли по 2х105 клеток на чашку (мм), через 1 сут добавляли ингибиторы HDAC и проводили подсчет клеток каждые 2 сут.

Оценку жизнеспособности популяции проводили с помощью окраски метилтиазолилдифенил-тетразолиум бромидом (МТТ) (Sigma, США). Метод основан на том, что дегидрогеназы митохондрий восстанавливают желтый МТТ до пурпурного формазана. Реакция происходит только в живых клетках с активными митохондриальными ферментами. Для MTT-теста клетки рассевали на 96-луночную плату, через 1 сут меняли среду и добавляли ингибиторы HDAC. Через 24 или 48 ч в каждую лунку добавляли 0.мг/мл МТТ в PBS, инкубировали 1 ч при 37 С в атмосфере 7.5 % CO2. Образовавшийся формазан экстрагировали в 0.04 М HСl на изопропаноле. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически при длине волны 570 нм против раствора МТТ в 0.04 М HCl на изопропаноле. За 100 % на калибровочной кривой принимали оптическую плотность клеток, не обработанных ингибиторами HDAC.

Распределение клеток по фазам клеточного цикла изучали с помощью однопараметрического анализа методом проточной цитофлуориметрии (Розанов, 1987).

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»