WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

3.1. Клонирование, идентификация и экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы и фрагментов гена родопсинкиназы.

Исходная конструкция, предположительно содержащая полноразмерный ген родопсинкиназы, была любезно предоставлена доктором М. Ахтаром (Department of Biochemistry, University of Southampton, United Kingdom). На первом этапе работы нами было проведено секвенирование гена и показано, что предоставленная кДНК соответствует гену родопсинкиназы.

Для проведения экспрессии гена родопсинкиназы нами была выбрана система экспрессии под контролем РНК-полимеразы фага Т7, предложенная Студиером [Studier et al., 1986]. С этой целью ген родопсинкиназы клонировали в вектор рТ7-7, содержащий последовательность промотора фага Т7, и трансформировали полученной конструкцией клетки штамма E.coli BL21 (DE3), в хромосоме которых имеется последовательность гена Т7 РНКполимеразы под контролем lac-промотора. Наличие lac-промотра позволяет индуцировать экспрессию гена Т7 РНК-полимеразы и, как следствие, гена, клонированного в рТ7-7, добавлением в культуральную среду синтетического аналога лактозы изопропил--Dтиогалактозида (ИПТГ).

Электрофореграмма экстракта клеток E.coli BL21(DE3) после проведения аналитической экспрессии полноразмерного гена родопсинкиназы, представленная на рис. 9, демонстрирует наличие белка с кажущейся молекулярной массой ~ 67 кДа, соответствующего родопсинкиназе. Уровень экспрессии полноразмерной родопсинкиназы в клетках E.coli, как следует из электрофореграммы, оказался невысоким. Последующие попытки выделения рекомбинантного белка были безрезультатными из-за низкого уровня экспрессии. Вследствие этого для проведения экспериментов нами было принято решение получить рекомбинантные фрагменты родопсинкиназы, соответствующие ее доменам.

Рис. 9. Экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы. Экстракт клеток E.coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pТ7-7-RK, до индукции ИПТГ (-ИПТГ) и после индукции 0,1 мМ ИПТГ (+ИПТГ). «М» – стандарты молекулярной массы.

Для получения рекомбинантных фрагментов родопсинкиназы нами был выбран плазмидный вектор pGEX5x-1 (Amersham Biosciences), содержащий ген глутатион S-трансферазы (КФ 2.5.1.18) из Schistosoma japonicum. Данная экспрессионная система позволяет проводить экспрессию генов в виде химерных белков, слитых в рамке считывания с глутатион S– трансферазой (GST), что облегчает выделение белков из клеточного экстракта с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном глутатионе [Smith, Johnson, 1988]. Нами были получены генетические конструкции, которые содержат фрагменты гена родопсинкиназы, кодирующие N-концевой домен (pGEX5x-1-N) и С-концевой домен (pGEX5x-1-С), слитые в рамке считывания с геном GST. Экспрессию генов химерных белков проводили в прокариотической системе с использованием штамма E. coli BL21. После индукции экспрессии генов с помощью ИПТГ образование белков анализировали с помощью SDSэлектрофореза экстрактов клеток (рис. 10). Данные, приведенные на рис. 10, указывают на образование рекомбинантных белков с молекулярной массой около 45 кДа и 38 кДа, что соответствует молекулярным массам белков, соответствующих N- и С- концевым доменам родопсинкиназы, экспрессирующимся в одной рамке считывания с GST (GST-N и GST-C).

Уровень экспрессии генов GST-N и GST-C оказался достаточно высоким, но основная часть данных белков накапливалась в форме нерастворимых телец включения. Причиной образования нерастворимых белков может быть как очень высокий уровень экспрессии генов, так и восстановление дисульфидных связей в белках [Lobel et al., 2001]. Для увеличения образования растворимой формы белков нами был проведен ряд экспериментов по оптимизации условий экспрессии, направленных на уменьшение скорости трансляции по следующим параметрам: температуре роста клеток в диапазоне 20-37С, оптической плотности клеточной культуры в диапазоне А600 от 0,5 до 1 до индукции и времени индукции в диапазоне от 30 минут до 3 часов. Однако любые попытки увеличить выход растворимой формы белка на стадии биосинтеза в бактериальных клетках не привели к успеху – количества растворимого химерного белка не превышали 100 мкг на 1 литр среды, в результате чего выделение химерных белков из клеточного экстракта оказалось невозможным. По этой причине нами было принято решение о выделении рекомбинантных белков GST-N и GST-C из образующихся телец включения. Мы опробовали действие ряда детергентов: Тритона Х-100, Твина-80 и лаурилсаркозина натрия на примере выделения GST-N. При этом было установлено, что наибольшее количество экстрагируемого химерного белка GST-N получается при солюбилизации телец включения в растворе, содержащем 1,5% лаурилсаркозин натрия и 2% Тритона Х-100. Поэтому в дальнейшем мы использовали именно эти детергенты для выделения фрагментов родопсинкиназы, слитых в рамке считывания с GST.

Рис. 10. Экспрессия рекомбинантных генов GST-N и GST-C. Экстракт клеток E.coli BL21, трансформированных плазмидой pGEX5x-1-N (GST-N) и pGEX5x-1-С (GST-C), до индукции ИПТГ (-ИПТГ) и после индукции 0,1 мМ ИПТГ (+ИПТГ). «М» – стандарты молекулярной массы.

С учетом полученных данных нами был разработан и оптимизирован метод получения и выделения химерных белков GST-N и GST-C, продуцируемых E. coli в виде нерастворимых телец включения. Метод состоит из следующих процедур: первая экстракция – удаление растворимых белков в нативных условиях, вторая экстракция – выделение нерастворимых белков в присутствии 1,5% лаурилсаркозина натрия и 2% Тритона Х-100 и последующая очистка химерных белков на иммобилизованном глутатионе. Фракции белков после каждой стадии выделения анализировали методом SDS-электрофореза (рис. 11).

3.2. Выявление доменов и сайтов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином.

Следующим этапом нашей работы было установление доменов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином. С этой целью мы использовали следующую систему. К суспензии глутатионсефарозы, на которой предварительно иммобилизовали очищенный химерный белок, содержащий GST, добавляли рековерин при конечной концентрации Са2+ в системе, равной 2 мМ. После инкубации реакционной смеси в течение 1 часа при 4С глутатионсефарозу трижды промывали буфером, содержащим 2 мМ CaCl2. Затем белки элюировали с помощью 1% SDS и полученные фракции анализировали методом SDSэлектрофореза.

Рис. 11. Выделение и очистка рекомбинантных белков GST-N (А) и GST-C (Б). «М» – стандарты молекулярной массы, «ЭК» – экстракт клеток E.coli BL21, «Р» - фракция растворимых внутриклеточных белков, «Н» – фракция нерастворимых внутриклеточных белков, солюбилизированных в растворе, содержащем 1,5% лаурилсаркозин натрия и 2% Тритон Х-100, «Элюат» – фракция белков после хроматографической очистки на глутатионсефарозе, элюирование 10 мМ глутатионом.

Перед началом исследования взаимодействия белков GST-N и GST-C с рековерином с использованием описанной системы, мы провели контрольные эксперименты по изучению взаимодействия GST с рековерином, из которых однозначно следует, что рекомбинантный белок GST сам по себе с рековерином не взаимодействует. Таким образом, данная система может быть использована для изучения взаимодействия белков GST-N и GST-C с рековерином.

Результаты эксперимента по связыванию химерных белков GST-N и GST-C с рековерином представлены на рис. 12. Как видно из представленных данных, N-концевой домен родопсинкиназы в составе химерного белка взаимодействует с рековерином. Напротив, взаимодействия между С-концевым доменом родопсинкиназы и рековерином не наблюдается.

Для более точной локализации участка N-концевого домена родопсинкиназы, вовлеченного во взаимодействие с рековерином, мы провели исследования с использованием синтетических пептидных фрагментов родопсинкиназы RK11-26 и RK2-16. Смысл эксперимента заключался в выяснении способности данных пептидных фрагментов конкурировать с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы за связывание с рековерином. Выбор пептидов обусловлен нашими предварительными результатами, из которых следует, что фрагмент родопсинкиназы 23Asp-471Pro, полученный путем ограниченного протеолиза фарнезилированного белка в присутствии Asp-N-эндопротеиназы, теряет способность взаимодействовать с рековерином. Из этого следует, что во взаимодействие с рековерином вовлечен участок 1-23 регуляторного N-концевого домена родопсинкиназы.

Рис. 12. Взаимодействие химерных белков GST-N и GST-C с рековерином. «М» – стандарты молекулярной массы; «Rc» – очищенный препарат рековерина; «-Rc» – фракция белков элюированных с глутатионсефарозы 1% SDS в отсутствие рековерина в инкубационной смеси; «+Rc» – фракция белков элюированных с глутатионсефарозы 1% SDS в присутствии рековерина в инкубационной смеси.

Эксперимент проводили в соответствии со следующей схемой. К суспензии глутатионсефарозы, на которую предварительно иммобилизовали очищенный химерный белок GSTN, добавляли рековерин при конечной концентрации Са2+ в системе 2 мМ. После инкубации реакционной смеси в течение 1 часа при 4С глутатионсефарозу трижды промывали буфером, содержащим 2 мМ CaCl2. Элюирование рековерина проводили одним из трех буферов, содержащих: (а) 1 мМ пептид RK11-26, (б) 1 мМ пептид RK2-16 или (в) 2 мМ Са2+ (в качестве контроля, чтобы исключить неспецифическое элюирование рековерина). Для определения количества рековерина, оставшегося связанным с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы после элюирования в каждом из трех экспериментов, препарат глутатионсефарозы обрабатывали буфером, содержащим 2 мМ ЭГТА.

На рис. 13 представлены результаты по Са2+-зависимому связыванию рековерина с Nконцевым доменом родопсинкиназы в присутствии и в отсутствие пептидных фрагментов родопсинкиназы RK2-16 и RK11-26.

Как следует из рис. 13, рековерин взаимодействует с N-концевым доменом родопсинкиназы в присутствии Са2+ (дорожка 3), тогда как при последующем элюировании буфером, содержащим ЭГТА, рековерин диссоциирует из комплекса с фрагментом родопсинкиназы (дорожка 4). Добавление синтетического пепетида, соответствующего амнокислотным остаткам 11-26 родопсинкиназы (RK11-26), полностью предотвращает взаимодействие рековерина с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы (дорожка 7), т.к. последующая обработка ЭГТА не приводит к дополнительному элюированию рековерина (дорожка 8). Однако добавление пептида RK2-16 практически не влияет на взаимодействие между рековерином и N-концевым доменом родопсинкиназы (дорожка 5), о чем свидетельствует значительное количество рековерина во фракции белков после элюции ЭГТА (дорожка 6).

Рис. 13. Конкуренция между химерным белком GST-N и пептидами RK11-26 и RK2-16 за взаимодействие с рековерином.

Таким образом, на основании наблюдаемой в ходе эксперимента конкуренции между фрагментом N-концевого домена RK11-26 и целым N-концевым доменом родопсинкиназы за взаимодействие с рековерином можно заключить, что участок RK11-26 регуляторного Nконцевого домена родопсинкиназы вносит основной вклад во взаимодействие родопсинкиназы и рековерина.

ВЫВОДЫ 1. Сродство рековерина к фоторецепторным мембранам возрастает при увеличении в них концентрации холестерина.

2. Повышение содержания холестерина в фоторецепторных мембранах приводит к уменьшению уровня фосфорилирования содержащегося в них родопсина вследствие усиления Са2+-зависимого ингибирования родопсинкиназы рековерином.

3. Связывание ионов кальция с Ca2+-связывающим центром рековерина EF2, но не EF3, обусловливает экспонирование неполярных боковых цепей гидрофобного “кармана” белка и тем самым – Ca2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы.

4. За взаимодействие родопсинкиназы с рековерином отвечает регуляторный Nконцевой домен фермента, причем основной вклад вносит ее фрагмент RK11-26.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Ваганова С.А., Сенин И.И., Чурюмова В.А., Зинченко Д.В., Заргаров А.А., Липкин В.М., Косh K.-W. Механизм Са2+-зависимого ингибирования рековерином фосфорилирования светоактивированного родопсина, катализируемого родопсинкиназой. Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва - Пущино, 25 ноября – 2 декабря, 2002, с.78.

2. Чурюмова В.А., Ваганова С.А., Зинченко Д.В., Заргаров А.А., Сенин И.И. Белковый дизайн Са2+-связывающего белка рековерина: создание искусственного кальций-связывающего участка в молекуле рековерина. Тезисы докладов 7-й Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 14-18 апреля, 2003, с. 3. Senin I.I., Hoppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P., Koch K.-W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergentresistant membrane rafts from rod outer segments. J. Biol. Chem. 2004; v. 279 (47); p.

48647-53.

4. Senin I.I., Hoeppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P., and Koch K.-W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergent-resistant membrane rafts from rod outer segments. 8th European symposium on calcium binding proteins in normal and transformed cells. Cambridge, UK, 30 July - August, 2004, p. 83.

5. Komolov K.E., Zinchenko D.V., Churumova V.A., Vaganova S.A., Weiergraber O.H., Senin I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. One of the Ca2+ binding sites of recoverin exclusively controls interaction with rhodopsin kinase. Biol. Chem. 2005; v. 386 (3); p. 285289.

6. Чурюмова В.А., Комолов К.Е., Сенин И.И., Филиппов П.П., Koch K.-W. Роль Са2+связывающих центров рековерина в Са2+-зависимой регуляции родопсинкиназы.

Тезисы докладов международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 6 – 9 июня, 2005, с. 220-222.

7. Чурюмова В.А., Сенин И.И., Hоeppner-Heitmann D., Тихомирова Н.К., Филиппов П.П., Koch K-W. Изучение влияния содержания холестерина в составе фоторецепторных мембран на процесс фосфорилирования родопсина, катализируемый родопсинкиназой. Тезисы докладов XVIII международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 7 – 10 февраля, 2006, с.70.

8. Weiergraber O.H., Senin I.I., Zernii E.Y., Churumova V.A., Kovaleva N.A., Nazipova A.A., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Philippov P.P., Granzin J., Koch K.-W. Tuning of a neuronal calcium sensor. J. Biol. Chem. 2006; v. 281 (49); p. 37594-37602.

9. Senin I.I., Churumova V.A., Philippov P.P., Koch K.-W. Membrane binding of the neuronal calcium sensor recoverin - modulatory role of the charged carboxy-terminus. BMC Biochem. 2007; v. 22; p. 24.

10. Komolov K.E., Senin I.I., Kovaleva N.A., Christoph M., Churumova V.A., Grigoriev I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. Mechanism of rhodopsin kinase regulation by recoverin. 13th International conference on retinal proteins. Barcelona, June 15 – 19, 2008, p.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»