WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Полумаксимальная константа ингибирования (K50) родопсинкиназы составила 6,6 мкМ рековерина в присутствии мембран НСП с исходным содержанием холестерина, равным 14%. В то время как в присутствии мембран НСП, содержащих 29,6% холестерина, значение K50 составляло 4,5 мкМ рековерина (таблица 1). Изменение содержания холестерина в мембранах НСП также оказывает влияние на зависимость ингибирования родопсинкиназы от концентрации ионов кальция: при увеличении концентрации холестерина от 4,1% до 29,6% величина K50 для ионов кальция сдвигается в область более низких значений концентрации свободного кальция ([Ca2+]f), а именно уменьшается от 4,31 мкМ до 0,82 мкМ [Ca2+]f (таблица 1).

Таблица 1. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации рековерина и свободного кальция при различном содержании холестерина в мембранах.

Содержание холестерина в мембране НСП 4,1% 14% 29,6% К50 [рековерин] 10,4 мкМ 6,6 мкМ 4,5 мкМ К50 [Ca2+]f 4,31 мкМ 2,43 мкМ 0,82 мкМ В настоящее время в литературе широко обсуждается влияние специфических мембранных доменов, нерастворимых в детергенте, (так называемых, рафт-структур) на процесвеличина сигнала, RU сы, имеющие отношение к клеточной сигнализации [Nair et al., 2002]. Рафт-структуры, обнаруженные в НСП, характеризуются высоким содержанием холестерина [Martin et al., 2005].

Наши результаты, демонстрирующие увеличение сродства рековерина к мембранам с повышенным содержанием холестерина, указывают на возможность нахождения рековерина и родопсинкиназы в составе рафт-структур. Поскольку мы показали что, Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы усиливается при условии высокого содержания холестерина в мембранах НСП, можно предположить, что этот процесс происходит более эффективно в рафт-структурах, чем в мембранах вне этих структур. Для подтверждения нашего предположения мы сравнили ингибирование активности родопсинкиназы в присутствии фоторецепторных мембран и рафт-структур, изолированных из мембран НСП.

Из графика зависимости активности родопсинкиназы от концентрации рековерина, представленного на рисунке 4А, следует, что ингибирование родопсинкиназы в присутствии рафт-структур происходит при немного меньших концентрациях рековерина по сравнению с мембранами НСП (К50 = 4,9 мкМ в рафт-структурах и 5,3 мкМ в фоторецепторных мембранах). Однако при исследовании зависимости активности родопсинкиназы от концентрации Ca2+ мы обнаружили существенный сдвиг К50 в сторону низких концентраций Ca2+ в присутствии рафт-структур (рис. 4Б). Это говорит о том, что Ca2+-зависимое ингибирование рековерином фосфорилирования родопсина более эффективно в рафт-структурах по сравнению с нативными фоторецепторными мембранами (К50 = 0,76 мкМ в рафт-структурах и 1,91 мкМ в фоторецепторных мембранах).

А Б фоторецепторные мембраны фоторецепторные мембраны рафт-структуры рафт-структуры 0,1 1 10 [рековерин], мкМ [Ca2+], мкМ Рис. 4. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации рековерина (А) и Са2+ (Б) в присутствии фоторецепторных мембран и рафт-структур.

Полученные нами данные говорят о том, что а) высокая концентрация холестерина способствует связыванию рековерина с мембранами и б) холестерин увеличивает эффективность ингибирования активности родопсинкиназы рековерином.

относительная активность родопсинкиназы, % относительная активность родопсинкиназы, % В одной из последних работ по изучению светозависимой транслокации сигнальных белков в фоторецепторной клетке обнаружены факты, указывающие на наличие градиента концентрации рековерина в НСП [Strissel et al., 2005]. В этой работе показано, что более высокая концентрация рековерина присутствует в базальной части НСП, т.е. градиент концентрации рековерина в НСП аналогичен таковому в случае холестерина. В соответствии с нашими данными можно полагать, что именно градиент концентрации холестерина в мембранах НСП обусловливает наблюдаемый градиент концентрации рековерина. Как уже было сказано выше, в НСП существует градиент концентрации холестерина: для базальных дисков до 30%, для апикальных – до 5%. По нашим данным, эффективность ингибирования родопсинкиназной активности рековерином также является гетерогенным процессом, т.к. в базальной части НСП эффективность ингибирующего действия рековерина выше, чем в апикальной области в результате сдвига значения полумаксимального эффекта ингибирования фермента в сторону низких концентраций свободного Са2+ и рековерина. Результаты наших экспериментов, полученные в условиях in vitro, объясняют описанные ранее наблюдения in vivo [Schnapf, 1983] о том, что выключение передачи светового сигнала в базальной части НСП происходит медленнее, чем в их апикальной области.

2. Исследование роли Са2+-связывающих центров рековерина в ингибировании родопсинкиназы.

К началу настоящей работы в нашей лаборатории были получены две мутантные формы рековерина, у которых не функционировал один из двух работающих в рековерине дикого типа (wt-рековерине) Са2+-связывающих центров (рис. 5). Это – мутант RcE85Q, у которого не функционирует центр EF2 вследствие замены остатка глутаминовой кислоты в 85м положении на остаток глутамина, и мутант RcE121Q, у которого не функционирует центр EF3 из-за аналогичной замены в 121-м положении. В дальнейшем при изучении мутантных форм рековерина с модифицированными Са2+-связывающими центрами было показано, что 2+ заполнение Са -связывающих центров катионами происходит последовательно. Сначала заполняется центр EF3 и лишь затем – центр EF2, при этом координация катионов центром EFявляется необходимым условием для последующего связывания ионов кальция в центре EF2.

Механизм последовательного заполнения Са2+-связывающих центров ионами кальция функционирует только в миристоилированном рековерине и не действует в его немиристоилированной форме [Permyakov et al., 2000, Senin et al., 2002].

Рековерин действует как Са2+-сенсор родопсинкиназы, ингибируя ее при относительно высоких концентрациях катиона. Связывание ионов кальция с молекулой рековерина приводит к экспонированию его гидрофобного “кармана”, в результате чего рековерин становится способным взаимодействовать с родопсинкиназой и ингибировать этот фермент [Tachibanaki et al., 2000]. Как уже было сказано выше, молекула рековерина содержит два функционирующих Са2+-связывающих центра, в то же время роль каждого из этих центров в ингибировании родопсинкиназы оставалась неустановленной. Казалось бы, ответ на этот вопрос мог быть получен с использованием мутантов рековерина, один из которых способен связывать ионы кальция во втором Са2+-связывающем центре, а другой – в третьем Са2+связывающем центре. Однако из-за того, что в миристоилированном рековерине функционирует вышеописанный механизм последовательного заполнения Са2+-связывающих центров ионами кальция, миристоилированный мутант RcE121Q с нефункционирующим третьим Са2+связывающим центром ионы кальция вообще не связывает [Senin et al., 2002]. Поскольку в немиристоилированном рековерине связывание ионов кальция с его Са2+-связывающими центрами происходит независимо [Ames et al., 1995], мы попытались ответить на вопрос о роли каждого из двух Са2+-связывающих центров рековерина в экспонировании его гидрофобного “кармана” и, соответственно, в ингибировании родопсинкиназы, используя немиристоилированные формы мутантов рековерина RcE85Q (содержит “испорченный” центр EF2) и RcE121Q (содержит “испорченный” центр EF3).

wt-рековерин EF1 EF2 EF3 EF 36 48 73 85 109 121 159 мутант RcE85Q E85Q мутант RcE121Q E121Q Рис. 5. Схема локализации Са2+-связывающих центров в wt-рековерине и его мутантах по второму (мутант RcE85Q) и третьему (мутант RcE121Q) центрам типа EF-hand. Центры, способные ( ) и не способные ( ) связывать Са2+, обозначены прямоугольниками.

Ранее было показано, что немиристоилированная форма мутанта RcE85Q, который содержит “испорченный” Са2+-связывающий центр EF2, способна связывать ионы кальция за счет Са2+-связывающего центра EF3 [Weiergraber et al., 2003]. Используя радиоактивный изотоп 45Са2+, мы показали, что немиристоилированная форма мутанта рековерина RcE121Q, несмотря на то, что в ней присутствует “испорченный” Са2+-связывающий центр EF3, способна, в отличие от миристоилированной форма этого мутанта, связывать ионы кальция за счет Са2+-связывающего центра EF2 (рис. 6). При этом величина константы диссоциации (KD) для ионов кальция составила 6,4 мкМ, что совпадает со значением KD для Са2+-связывающего центра EF2 в рековерине дикого типа по данным в работе [Ames et al., 1995].

Показателем экспонирования гидрофобного “кармана” рековерина может служить его способность взаимодействовать с гидрофобным носителем фенилсефарозой [Polans et al., 1991]. В связи с этим мы исследовали связывание немиристоилированных форм мутантов рековерина RcE85Q и RcE121Q и рековерина дикого типа с фенилсефарозой. Исследуемые формы рековерина инкубировали в присутствии суспензии фенилсефарозы в диапазоне [Са2+]f от 10 нМ до 100 мкМ; степень связывания указанных форм рековерина с носителем определяли по количеству белка, оставшегося в растворе после осаждения фенилсефарозы.

1,0,0,0,0,0,0,1 1 10 100 [Ca2+]f, мкМ Рис. 6. Связывание 45Са2+ с немиристоилированной формой мутанта RcE121Q.

Как было показано ранее [Senin et al., 2002], миристоилированный wt-рековерин Са2+зависимым образом взаимодействует с фенилсефарозой, тогда как миристоилированные мутанты RcE85Q и RcE121Q такой способностью не обладают. Это говорит о том, что оба мутанта в присутствии ионов кальция не экспонируют гидрофобные аминокислотные остатки, необходимые для взаимодействия с гидрофобной матрицей. Используя немиристоилированные формы рековерина, мы показали, что немиристоилированный wt-рековерин способен, подобно миристоилированной форме белка, Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фенилсефарозой (рис. 7). Оказалось, что немиристоилированный мутант RcE121Q, несмотря на отсутствие в нем функционального центра EF3, взаимодействует с фенилсефарозой аналогично wt-рековерину. При этом взаимодействие происходит в том же диапазоне [Са2+]f, что и при заполнении катионом нативного Са2+-связывающего центра EF2 в wt-рековерине. В от2+ связанный Са, моль/моль белка личие от мутанта RcE121Q, немиристоилированный RcE85Q, хотя и связывает ионы кальция за счет центра EF3, с фенилсефарозой не взаимодействует.

80 - wt-рековерин - RcE85Q - RcE121Q 0,001 0,01 0,1 1 10 [Ca2+]f, мкМ Рис. 7. Са2+-зависимое связывание немиристоилированных форм рековерина с фенилсефарозой.

За 100% принято общее количество рековерина в пробе. Величина K50 для рековерина дикого типа составила 1,19 мкM, для RcE121Q – 1,48 мкM.

Следовательно, можно сделать вывод, что заполнение ионами кальция центра EF2, но не EF3, определяет способность рековерина взаимодействовать с фенилсефарозой и что координация ионов кальция именно в Са2+-связывающем центре EF2 необходима для экспонирования гидрофобного “кармана” рековерина. Этот вывод в свою очередь предполагает, что координация ионов кальция в Са2+-связывающем центре EF2 необходима для придания рековерину способности ингибировать родопсинкиназу. Правильность этого предположения подтвердили наши последующие эксперименты по исследованию способности немиристоилированных форм wt-рековерина и мутантов RcE85Q и RcE121Q ингибировать родопсинкиназу Ca2+-зависимым образом.

В этих экспериментах активность родопсинкиназы измеряли по включению радиоактивного фосфата [32Р]-АТФ в родопсин в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной фоторецепторные мембраны, очищенную родопсинкиназу и исследуемые формы рековерина. Концентрацию свободного кальция варьировали в диапазоне от 1 нМ до 100 мкМ. Как следует из рис. 8, немиристоилированный мутант RcE121Q, который содержит “испорченный” Са2+-связывающий центр EF3 и, соответственно, координирует ионы кальция только за счет Са2+-связывающего центра EF2 способен ингибировать родопсинкиназу Са2+зависимым образом. При этом величина K50 по Сa2+ для данного мутанта близка к таковой для wt-рековерина, хотя и несколько сдвинута в область более высоких концентраций ионов кальция. В то же время, немиристоилированный мутант RcE85Q, в котором “испорчен” Са2+количество связанного рековерина, % связывающий центр EF2 и который координирует ионы кальция только за счет Са2+связывающего центра EF3, не способен ингибировать родопсинкиназу.

- wt-рековерин - RcE85Q - RcE121Q 0,001 0,01 0,1 1 10 [Ca2+]f, мкM Рис. 8. Са2+-зависимое ингибирование активности родопсинкиназы немиристоилированными формами wt-рековерина и мутантами RcE85Q и RcE121Q. За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина. Величина K50 для рековерина дикого типа составила 0,мкM, для RcE121Q – 3 мкM.

Таким образом, описанные эксперименты прямо показывают, что именно связывание ионов кальция в Ca2+-связывающем центре EF2 обеспечивают взаимодействие рековерина с родопсинкиназой и ее ингибирование.

3. Выявление сайтов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином.

Биохимические эксперименты на препаратах НСП in vitro продемонстрировали, что рековерин ингибирует фосфорилирование родопсина, взаимодействуя с родопсинкиназой [Klenchin et al., 1995, Senin et al., 2005]. Можно предположить два механизма ингибирования.

Согласно первому механизму, рековерин непосредственно действует на каталитическую активность родопсинкиназы, взаимодействуя с ее каталитическим доменом. Согласно второму, рековерин стерически препятствует формированию фермент-субстратного комплекса родопсинкиназы с фотоактивированным родопсином, не затрагивая активный центр фермента. В предыдущих работах показано, что родопсинкиназа в присутствии рековерина теряет способность фосфорилировать светоактивированный родопсин. При этом рековерин не оказывает влияния на процесс фосфорилирования родопсинкиназой 11-членного пептидного субстрата, гомологичного фрагменту родопсина, который содержит сайты фосфорилирования.

Эти данные предполагают, что рековерин блокирует участок родопсинкиназы, необходимый относительная активность родопсинкиназы, % для узнавания светоактивированного родопсина, не оказывая влияние на каталитическую активность фермента как такового. Рековерин ингибирует родопсинкиназу посредством взаимодействия с участком, удаленным от каталитического центра, следовательно, потенциальными сайтами связывания рековерина могут быть участки, находящиеся в регуляторных N- и C-концевых доменах родопсинкиназы.

Целью настоящего раздела работы было выяснение локализации участков родопсинкиназы, отвечающих за ее взаимодействие с рековерином. Для ответа на этот вопрос нами была получена рекомбинантная родопсинкиназа, а также рекомбинантные фрагменты фермента, соответствующие его N-концевому (RK1-183) и C-концевому (RK455-561) доменам, и изучено их взаимодействие с рековерином.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»