WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи

ЧУРЮМОВА Валерия Александровна ИЗУЧЕНИЕ Ca2+/РЕКОВЕРИН-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ РОДОПСИНА, КАТАЛИЗИРУЕМОГО РОДОПСИНКИНАЗОЙ 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в отделе сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор П.П. Филиппов кандидат химических наук, старший научный сотрудник И.И. Сенин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Н. Чернов доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Е.Н. Иомдина

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «_» 2008 г. в _ часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» _ 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ионы кальция служат универсальным регулятором самых разнообразных процессов, протекающих в живой клетке. Воздействие ионов кальция на эти процессы в большинстве случаев опосредовано Са2+-связывающими белками. За связывание ионов кальция у большинства Са2+-связывающих белков отвечает специальная структура, получившая название “EF-hand”. Многие из белков, содержащих EF-hand-структуру, служат сенсорами ионов кальция для различных мишеней в клетках различных типов, например, в нейронах. Так, в настоящее время известно более сорока представителей EF-hand-содержащих Са2+-связывающих белков, специфичных для нервной ткани, которые составляют семейство нейрональных Са2+-сенсоров (neuronal calcium sensors, NCS). Белки семейства нейрональных Са2+-сенсоров выполняют регуляторную роль в отношении различных внутриклеточных белков-мишеней таких, как: протеинкиназы, гуанилатциклазы, аденилатциклазы и ионные каналы. Изменение внутриклеточной концентрации Са2+ определяет компартментализацию (раствор/мембрана) многих белков этого семейства, что в свою очередь модулирует их взаимодействие с сигнальными партнерами.

Типичным представителем семейства нейрональных Са2+-сенсоров является рековерин, высокоспецифичный для фоторецепторных клеток сетчатки, представляющих собой высокоспециализированные нейроны. Функция рековерина в фоторецепторной клетке заключается в Са2+-зависимой регуляции десенситизации фотоактивированного рецептора (родопсина) путём его фосфорилирования, катализируемого ферментом родопсинкиназой. При высокой концентрации ионов кальция рековерин находится в комплексе с фоторецепторной мембраной и взаимодействует с родопсинкиназой, что приводит к ингибированию фермента.

Тогда как при низких концентрациях катиона комплекс родопсинкиназа-рековерин диссоциирует и ингибирование снимается. Процесс Са2+-зависимого ингибирования фосфорилирования родопсина происходит на фоторецепторной мембране при непосредственном взаимодействии рековерина и родопсинкиназы.

Актуальность данной работы обусловлена тем, что в настоящее время отсутствует полная информация о механизме Са2+-зависимого взаимодействия рековерина и его внутриклеточной мишени родопсинкиназы, а также роли фосфолипидного матрикса фоторецепторной мембраны в функционировании этих белков.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – изучение механизмов Са2+-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина родопсинкиназой. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи.

• Выявление сайтов родопсинкиназы и рековерина, ответственных за взаимодействие этих двух белков.

• Изучение влияния состава фоторецепторной мембраны на регуляцию фосфорилирования родопсина.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе выявлен участок молекулы родопсинкиназы, принимающий участие во взаимодействии с ее внутриклеточным регулятором рековерином. Установлено, что заполнение Са2+-связывающего центра EF2 рековерина ионами кальция непосредственно контролирует экспонирование гидрофобного “кармана” и миристоильного остатка, и, как следствие, взаимодействие рековерина с его мишенью – родопсинкиназой. Продемонстрировано влияние изменения содержания холестерина в составе фоторецепторных мембран на Са2+-зависимое связывание рековерина с мембранами. Показано, что повышение концентрации холестерина в составе мембран увеличивает способность рековерина ингибировать родопсинкиназу в результате сдвига полумаксимального эффекта ингибирования в сторону низких концентраций свободного Са2+ и рековерина.

Практическая ценность работы заключается в том, что рековерин является одним из ключевых белков-регуляторов процесса фототрансдукции в фоторецепторной клетке, нарушение которого приводит к целому ряду зрительных патологий. Понимание молекулярных механизмов передачи зрительного сигнала необходимо для разработки эффективных методов лечения заболеваний зрения.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, на семинарах отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ МГУ, на 7-й Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2003), международной конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (Пущино, 2005) и на XVIII международной зимней молодежной научной школе “Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии” (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 37 рисунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает 209 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Родопсинкиназа, или GRK1, фермент, фосфорилирующий родопсин, представляет собой первую обнаруженную протеинкиназу семейства GRK [Lorenz et al., 1991]. Как и другие представители этого семейства протеинкиназ, родопсинкиназа фосфорилирует только стимулированную (светоактивированную) форму родопсина (Rho*). На основании первичной структуры фермента и гомологии с другими представителями семейства Ser/Thrпротеинкиназ в молекуле родопсинкиназы (RK) выделяют три основных домена: центральный каталитический домен (RK184-454), ограниченный N- и C- концевыми регуляторными доменами (соответственно RK1-183 и RK455-561). С-концевой домен родопсинкиназы содержит СААХ-мотив (CysValLeuSer561), который служит сигналом для присоединения фарнезильной группы к остатку цистеина, и сайты аутофосфорилирования (Ser448, Thr489).

Регуляция родопсинкиназы происходит при участии Са2+-связывающего белка рековерина, специфично экспрессирующегося в клетках сетчатки. Молекула рековерина содержит 4 потенциальных Са2+-связывающих центра типа EF-hand, из которых только два, а именно второй и третий (EF2 и EF3 соответственно) способны связывать ионы кальция. Основными следствиями связывания ионов кальция с рековерином, белком, в котором функционирует “Са2+-миристоильный переключатель” (calcium-myristoyl switch), является: а) экспонирование гидрофобного “кармана” рековерина и б) экспонирование миристоильного остатка, ковалентно присоединенного к N-концевому остатку рековерина. Это придает рековерину способность Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фоторецепторными мембранами и ингибировать его внутриклеточную мишень – родопсинкиназу.

Предыдущие исследования [Klenchin et al., 1995] показали, что ингибирование родопсинкиназы под действием рековерина происходит при непосредственном взаимодействии этих двух белков. Однако механизм этого взаимодействия изучен не был, в частности, оставались неизвестными структурные участки, ответственные за связывание рековерина с его внутриклеточной мишенью. Кроме того, не было исследовано влияние фосфолипидного окружения (состава фоторецепторных мембран) на функционирование рековерина и родопсинкиназы. Используя мутантные формы рековерина и рекомбинантные фрагменты родопсинкиназы, мы попытались ответить на эти вопросы в настоящей работе.

1. Влияние содержания холестерина фоторецепторных мембран на взаимодействие рековерина с мембранами и регуляцию фосфорилирования родопсина.

Большинство процессов, имеющих отношение к фототрансдукции и ее регуляции, происходят непосредственно на мембране. Поэтому в основе обнаруженной способности рековерина ингибировать родопсинкиназную активность может лежать как прямое взаимодействие рековерина с родопсинкиназой, так и механизмы, вовлекающие фоторецепторную мембрану.

Известно, что в мембране фоторецепторных дисков, содержащихся в наружных сегментах палочки (НСП), обнаружена пространственная гетерогенность содержания холестерина. Так, на новообразованные диски у основания НСП (базальные диски) приходится подавляющая часть массы холестерина, что составляет приблизительно 30% от общего количества липидов, в то время как на диски у окончания НСП (апикальные диски) – всего лишь 5% [Boesze-Battaglia et al., 1990]. К моменту начала настоящей работы имелись данные, указывающие на пространственную неоднородность процессов передачи сигнала в НСП. Обнаружено, что ответ на единичный фотон, регистрируемый на конце НСП, имеет меньшую амплитуду, чем ответ, регистрируемый у его основания [Schnapf, 1983]. Можно предположить, что эти различия кинетики фотоответа обусловлены составом фоторецепторной мембраны и, в частности, различным содержанием холестерина.

Для изучения влияния холестерина на регуляцию фосфорилирования светоактивированного родопсина мы получили фоторецепторные мембраны с различным содержанием холестерина: от 4,1 до 29,6%; при том, что нативные мембраны НСП содержат в среднем 14% холестерина. С использованием полученных мембран мы провели измерение влияния содержания холестерина на взаимодействие миристоилированного рековерина с мембранами НСП и фосфолипидными везикулами при насыщающих концентрациях Са2+. (Исследование немиристоилированных форм не проводились, т.к. они с фоторецепторными мембранами не взаимодействуют.) В результате установлено, что с увеличением содержания холестерина от 4,1% до 29,6% количество рековерина, связанного с мембранами НСП, повышается (рис. 1А).

А Б 4,1% холестерина 14% холеcтерина 29,6% холестерина 10 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 [родопсин], мкМ холестерин, % Рис. 1. Связывание рековерина с фоторецепторными мембранами и фосфолипидными везикулами, содержащими различное количество холестерина.

Далее мы исследовали взаимодействие рековерина с фосфолипидными везикулами, содержащими фосфатидилэтаноламин (РЕ) и фосфатидилхолин (РС) в соотношении 50:50 с градиентом содержания холестерина (5-50%) при насыщающих концентрациях Са2+. Обнаколичество связанного рековерина, % количество связанного рековерина, % ружено, что связывание рековерина с фосфолипидными везикулами увеличивается при возрастании концентрации холестерина по сравнению с везикулами, не содержащими холестерин (рис. 1Б).

Таким образом, результаты нашего исследования взаимодействия рековерина с фоторецепторными мембранами и фосфолипидными везикулами, содержащими различные концентрации холестерина, позволяют сделать вывод о том, что связывание рековерина с мембранами зависит от содержания в них холестерина.

Для подтверждения полученных результатов по влиянию холестерина на взаимодействие рековерина с мембранами мы использовали альтернативный метод – спектроскопию поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance, SPR). С помощью метода SPR мы исследовали влияние холестерина на взаимодействие рековерина с иммобилизованным фосфолипидным бислоем. В этих экспериментах мы использовали систему “рековерин - искусственная фосфолипидная мембрана”. В этой системе искусственный липидный бислой образует однородную поверхность на SPR-чипе и присутствует в неподвижной фазе в течение хода эксперимента, в то время как рековерин находится в составе растворимой фазы, подвижной относительно иммобилизованного липидного бислоя.

Для иммобилизации на гидрофобный сенсорный чип мы приготовили смесь фосфолипидов двух типов: а) РЕ и РС (50:50) и б) РЕ, РС и холестерина (25:25:50). Полученные чипы использовали для измерения взаимодействия рековерина с иммобилизованными липидами в присутствии насыщающей концентрации Са2+. При иммобилизации смеси липидов, содержащей холестерин, максимальная амплитуда сигнала связывания возрастала приблизительно в 2 раза по сравнению с сигналом в отсутствие холестерина (рис. 2).

Рис. 2. SPR-сенсограммы, отражающие взаимодействие рековерина с иммобилизованным липидным бислоем. Концентрация СаCl2 составляла 200 мкМ, рековерина – 5 мкM. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутствует (не закрашено) и присутствует (закрашено черным) рековерин.

Варьирование концентрации рековерина в условиях насыщающих концентраций ионов кальция привело к такому же результату: в присутствии холестерина максимальная амплитуда сигнала связывания была в 2 раза выше, чем без него (рис. 3).

PE:PC PE:PC:холестерин 0 20406080 [рековерин], мкМ Рис. 3. Зависимость связывания рековерина с иммобилизованным липидным бислоем от концентрации белка. Липидный бислой содержал РЕ:РС в соотношении 50:50 или РЕ:РС:холестерин в соотношении 25:25:50.

Далее мы изучили зависимость ингибирования активности родопсинкиназы от концентрации рековерина и Са2+ при различных концентрациях холестерина в мембранах НСП.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»