WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Инкубация реиннервированного нервно-мышечного препарата m.EDL мыши с нифедипином приводила к значительному облегчению секреции медиатора. Квантовый состав ПКП достоверно увеличивался от 12,2±1,5 в контроле до 19,4±2,3 (p<0,05). Последующее добавление рианодина в концентрации, блокирующей РиР (5 мкМ), не вызывало дополнительного прироста амплитуды или квантового состава одиночных ПКП. Квантовый состав на фоне совместного действия нифедипина и рианодина составил 17,7±1,5 (n=69).

Таким образом, наши данные показывают, что в новообразованных нервномышечных синапсах мыши Са2+-зависимое торможение секреции медиатора может происходить с участием как минимум, двух типов Са2+-сигналов:

поступлении наружного кальция по Са2+-каналам L-типа и сопряженном с ним выбросе депонированного кальция через РиР.

Каковы возможные молекулярные мишени этих тормозных кальциевых сигналов, оставалось неясным. Данные литературы свидетельствуют, что Са2+зависимое торможение секреции медиатора может происходить с участием Са2+активируемых К+-каналов либо Са2+-зависимых ферментов нервных терминалей.

В связи с этим, в следующих сериях работы были исследованы пресинаптические эффекты избирательных блокаторов К+ -каналов и ряда Са2+-зависимых Са ферментов.

3. ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ КАЛЬЦИЙ-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ НА СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ.

В этой серии экспериментов были изучены эффекты избирательных блокаторов К+ -каналов двух разных типов: апамина (блокатора Са низкопроводящих К+ -каналов SK-типа) и паксиллина (блокатора Са высокопроводящих К+ -каналов BK-типа) на амплитуду и квантовый состав ПКП Са новообразованных синапсов m.EDL мыши.

Мы установили, что апамин (0,5 мкМ) не вызывает достоверных изменений амплитуды и квантового состава одиночных ПКП или картины залповой активности новообразованных синапсов. Так, уровень фазы плато в контроле был равен 121,71±0,33% от амплитуды ПКП1, а на фоне действия апамина – 123,75±0,36% (n=45). Эти данные говорят о полном неучастии низкопроводящих (SK) K+Ca-каналов в регуляции секреции медиатора в реиннервированных синапсах.

Под действием паксиллина (1 мкМ) квантовый состав ПКП новообразованных синапсов претерпевает небольшое, но достоверное увеличение. В контроле значение квантового состава ПКП равнялось 13,4±2, а на фоне паксиллина – 16,3±1,1 (p<0,05). Однако при последующем добавлении в омывающий раствор нифедипина наблюдался дополнительный прирост квантового состава ПКП до 20,2±2, что достоверно (p<0,05) превышает значения квантового состава в контроле и на фоне действия паксиллина (n=84). Тот факт, что на фоне действия паксиллина аппликация нифедипина приводит к дополнительному повышению квантового состава ПКП (сопоставимому с облегчающим действием чистого нифедипина) указывает на не связанное между собой функционирование Са2+-каналов L-типа и K+Ca-каналов BK-типа в новообразованных синапсах.

Подтверждает этот вывод и гистограмма распределений амплитуд ПКП, приведенная на рисунке 5.

Видно, что паксиллин приводит к относительно небольшому симметричному сдвигу огибающей гистограммы в сторону высоких амплитуд, но нифедипин на этом фоне дает еще более сильный сдвиг в высокоамплитудную область и вызывает появление дополнительного пика на гистограмме, характерного именно Рис. 5. Гистограмма амплитудных распределений для эффектов блокады Са2+-каналов ПКП новообразованных синапсов на фоне L-типа.

действия паксиллина и последующего Таким образом, полученные добавления нифедипина.

данные свидетельствуют о том, что Са2+-ток, входящий в терминаль по каналам L-типа, вызывает торможение секреции АХ без участия K+Ca-каналов.

4. ВЛИЯНИЕ КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ НА СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ МЫШИ.

В качестве дальнейшего шага в поисках механизма Са2+–зависимого торможения в новообразованных синапсах мыши мы предположили, что кальций, входящий в терминаль по каналам L-типа, может избирательно активировать Са2+-зависимые ферменты, которые далее и осуществляют торможение секреции АХ. Действительно, в нервных терминалях центральных и периферических синапсов описаны многочисленные белки и ферменты, активность которых избирательно регулируется ионами кальция. К их числу принадлежат, в частности, кальмодулин, кальмодулинкиназы, протеинкиназы С (PKС) (Colbran, Brown, 2004; Yamauchi, 2005; Dunlap, 2007; Liu et al., 2007; Santafe et al, 2007;

Shakiryanova et al., 2007; Wong et al., 2009). Их возможное участие в Са2+зависимом торможении секреции АХ мы исследовали в следующих сериях нашей работы.

4.1. Влияние блокады кальмодулина и CaMKII на параметры одиночной вызванной секреции в новообразованных синапсах.

Блокада кальмодулина при помощи его специфического антагониста R24571 (кальмидазола) в концентрации 2 мкМ никак не повлияла на амплитуду и квантовый состав одиночных ПКП в течение 90 минут инкубации с этим реагентом. Так, квантовый состав ПКП составил 11,74±0,63 в контроле и 11,22±1,07 на фоне действия кальмидазола (p>0,05, n=53). Это свидетельствует о том, что если кальций, входящий в терминаль по каналам L-типа, и воздействует на кальмодулин аксоплазмы, то это никак не отражается на вызванных одиночных актах секреции АХ. По-видимому, активность кальмодулина не принимает участия в Са2+-зависимом торможении секреции медиатора.

На протяжении 90 минут инкубации с блокатором CaMKII KN-62 (3 мкМ) квантовый состав ПКП также не изменился: его значение составило 11,03±0,84 в контроле и 10,65±0,9 на фоне действия KN-62 (p>0,05, n=41).Полученные данные означают, что CaMKII тоже, по видимому, не является той мишенью, на активацию которой направлен Са2+-сигнал, формирующийся в терминали при входе кальция по L-типу Са2+-каналов в новообразованных моторных сианпсах мыши.

Однако по данным литературы, активность данного фермента может двунаправлено регулироваться и неоднозначно зависеть от действия различных Са2+-сигналов (Liu et al., 2007; Wang, 2008). В связи с этим, в следующей серии экспериментов мы проводили блокаду CaMKII на фоне вызванного нифедипином облегчения секреции медиатора.

4.2. Влияние блокады CaMKII на активность новообразованных синапсов на фоне действия нифедипина.

Нифедипин вызывал увеличение квантового состава ПКП на 74,4±6,37% и увеличение амплитуды ПКП на 58,4±7,32% (р<0,05). При этом амплитуда МПКП достоверно не изменялась.

На фоне вызванного нифедипином пресинаптического облегчения передачи, блокатор CaMKII KN-62 вызывал достоверное снижение квантового состава ПКП до исходных контрольных значений. Аналогично снижалась и амплитуда ПКП (p<0,05). То есть KN-62 полностью подавлял вызванный нифедипином прирост амплитуды и квантового состава ПКП (n=68).

Таким образом, нами впервые было показано, что облегчающее действие CaMKII на секрецию медиатора в новообразованных моторных терминалях полностью купируется кальциевым сигналом, возникающим в терминалях при входе кальция по L-типу Са2+-каналов. Однако при блокаде этого сигнала специфическим блокатором нифедипином может проявляться способность CaMKII облегчать секрецию медиатора и вызывать прирост амплитуды и квантового состава ПКП.

Возможность неактивного (или подавленного) состояния СаМКII на фоне действия в терминалях Са2+-сигналов определенной модальности и генеза недавно показана в центральных синапсах. В новообразованных синапсах гиппокампа, в частности, это объясняется функционированием СаМКII в едином надмолеклуярном комплексе с Са2+-зависимыми фосфатазами, чья активность может доминировать и маскировать активность СаМКII (Menegon et al., 2002).

Наряду с анализом возможной роли CaMKII, представлялось интересным исследовать возможное участие и другого Са2+-зависимого фермента, протеинкиназы С которая могла бы активироваться входящим в терминаль кальциевым L-током и принимать участие в торможении секреции АХ (Maasch et al., 2000).

Роль РКС и механизмы ее действия в новообразованных синапсах мало изучены. Поэтому мы решили проверить возможность ее вклада в исследуемый тормозный эффект.

4.3. Влияние блокады PKC на активность новообразованных синапсов.

Мы установили что два разных по химической структуре блокатора PKC – хелеритрин (4 мкМ) и бисиндолилмалеимид I (BIM) (1 мкМ) – вызывают достоверный (p<0,05) прирост квантового состава ПКП на 58% (от 11,9±1,2 в контроле до 18,6±2,2; n=48) и 66% (от 12,3±2,1 в контроле до 20,4±2,4; n=45) соответственно, что сопоставимо с облегчающим действием нифедипина. Более того, на фоне блокады PKC происходят характерные изменения формы гистограммы амплитудного распределения ПКП – дисперсия сигналов и появление полимодальности, аналогичные наблюдаемым при действии нифедипина (рис. 6).

Полученные данные позволяют предположить, что, возможно, не только CaMKII, но и PKС также является мишенью для кальция, входящего по каналам L-типа в незрелые моторные нервные терминали реиннервирумых мышечных волокон m.EDL.

В настоящее время в научной литературе мало данных о возможности избирательной Рис. 6. Гистограмма амплитудных распределений прицельной активации PKС одиночных ПКП новообразованных синапсов под действием хелеритрина.

кальцием, входящим в терминаль по каналам L-типа. Такая возможность показана, например, для хромафинных клеток (Park, Kim, 2009). Мы исследовали возможность такой активации PKС в новообразованных синапсах мыши. Для этого в следующей серии анализировали действие хелеритрина на параметры ПКП на фоне блокады Са2+-каналов L-типа нифедипином.

4.4. Действие хелеритрина на активность новообразованных синапсов на фоне блокады Ca2+-каналов L-типа.

Если PKС действительно может активироваться входом кальция через Са2+каналы L-типа, то на фоне блокады этих каналов не должно происходить дополнительного прироста квантового состава ПКП при последующей инактивации PKС.

Действительно, в контроле квантовый состав равнялся 11,4±0,95, на фоне действия нифедипина достоверно возрастал до 17,47±1,3 (p<0,05), но при последующем добавлении хелеритрина достоверно не изменился и составил 16,14±1,(n=72). Не происходило также и дополнительных изменений формы Рис. 7. Изменение квантового состава одиночных гистограммы амплитудных ПКП новообразованных синапсов под действием хелеритрина, BIM, нифедипина и совместным распределений (рис. 7).

действием нифедипина и хелеритрина. Данные Полученные данные приведены в процентах от контроля.

позволяют предполагать, что в новообразованных синапсах PKС чувствительна к кальцию, поступающему по Са2+-каналам L-типа, и ее активность в этом случае направлена и сопряжена с Са2+-зависимым торможением секреции медиатора.

5. ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ ПОТЕНЦИАЛ-АКТИВИРУЕМЫХ К+-КАНАЛОВ НА АКТИВНОСТЬ НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСОВ.

В настоящее время известно, что моторные нервные терминали периферических синапсов позвоночных обладают разнообразным пулом К+каналов, в том числе - потенциал-активируемыми К+-каналами (обозначаемыми как K+v-каналы), избирательно блокируемыми тетраэтиламмонием, дендротоксином и 4-аминопиридином (Зефиров, Ситдикова, 2002) и обеспечивающими вторую фазу пресинаптического потенциала действия. От активности этих каналов и длительности второй фазы пресинаптического потенциала действия будет зависеть поступление в терминаль триггерного кальциевого тока (по P/Q-каналам), запускающего выброс медиатора.

В связи с этим, мы решили проверить, не могут ли в качестве субстрата для PKС выступать K+v-каналы терминали. Для этого мы исследовали эффекты двух разных по химической природе и механизмам действия блокаторов K+v-каналов – 4-аминопиридина и бутандионмоноксима (BDM), и их взаимодействие с эффектами блокады PKC.

5.1. Влияние 4-аминопиридина и BDM на одиночную вызванную активность новообразованных синапсов.

Добавление в экспериментальный раствор BDM в концентрации 20 мМ приводило к значительному достоверному возрастанию амплитуды ПКП реиннервированных синапсов: в контроле средняя амплитуда ПКП равнялась 6,7±0,26 мВ, а после добавления BDM – 12,2±1,3 мВ (p<0,05). Квантовый состав ПКП также увеличивался от 11,3±1 в контроле до 25,4±2,8 (p<0,05, n=39) (рис. 8).

При аппликации 4-аминопиридина амплитуда ПКП возрастала от 9,8±0,мВ в контроле до 14,8±1,18 мВ. (p<0,05). Квантовый состав увеличился от контрольного значения 18,8±1,98 до 29,5±2,13 на фоне действия 4-аминопиридина (p<0,05, n=54), т.е. на 57%, что сравнимо с облегчающими эффектами при блокаде Ca2+-каналов L-типа или PKС (рис. 8).

Оба блокатора также вызывали не только сдвиг гистограмм амплитудных распределений ПКП в область высокоамплитудных значений, но и их дисперсию, расширение и распад на несколько пиков, подобно действию Рис. 8. Гистограмма амплитудных распределений одиночных ПКП новообразованных синапсов под нифедипина.

действием BDM и 4-АР.

5.2. Влияние 4-аминопиридина на активность новообразованных синапсов в условиях блокады PKC.

В последней серии экспериментов мы проверяли возможность регуляции K+v-каналов PKС в реиннервированных синапсах мыши. Для этого исследовали изменения амплитуды и квантового состава ПКП, вызываемые 4аминопиридином, на фоне предварительной блокады PKС хелеритрином.

Хелеритрин вызывал прирост амплитуды и квантового состава ПКП новообразованных синапсов. Так, в контроле квантовый состав равнялся 14,3±1,6, а после инкубации с хелеритрином – 20,5±1,7 (p<0,05). На этом фоне 4аминопиридин терял свою способность к дальнейшему облегчению секреции медиатора и квантовый состав равнялся 20,7±2 (p>0,05, n=73) (рис. 9). Амплитуда же и частота спонтанной секреции оставались неизменными под действием обоих веществ.

Рис. 9. Изменение квантового состава и амплитуды одиночных ПКП новообразованных синапсов под действием хелеритрина и 4-аминопиридина на фоне хелеритрина. а) Квантовый состав ПКП, б) Гистограммы амплитудных распределений ПКП.

Блокада K+v-каналов на фоне предварительной блокады PKC не приводит к дополнительным сдвигам или изменению формы гистограммы амплитудных распределений ПКП (рис. 9).

При проведении противоположной процедуры, когда на фоне предварительного блока K+v-каналов 4-аминопиридином мы провели воздействие на нервно-мышечный препарат хелеритрином, оказалось, что хелеритрин также теряет способность вызывать дополнительный прирост амплитуды или квантового состава ПКП. В этом случае квантовый состав от контрольного уровня в 17,3±2,06 поднялся до 28,9±2,2 на фоне действия 4-аминопиридина (p<0,05) и остался равным 28,9±2,4 при дальнейшей аппликации хелеритрина (p>0,05, n=62).

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»