WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Также были изучены пресинаптические эффекты агониста Са2+-каналов Lтипа S(-)-BAY К 8644 в концентрации 1 мкМ на параметры ритмически генерируемых ПКП.

1.1. Влияние модуляции активности Са2+-каналов L-типа на одиночную вызванную секрецию медиатора в интактных и новообразованных синапсах.

Предварительный анализ параметров вызванных одиночных ПКП показал существенные различия в амплитуде, латентном периоде и длительности сигналов в новообразованных и зрелых синапсах (рис. 1), а также в характере их ответов на действие нифедипина.

Мы установили, что нифедипин оказывает значительное облегчающее действие на секрецию медиатора в новообразованных синапсах: амплитуда одиночных ПКП увеличилась от 6,5±0,9 мВ (в контроле) до 9,3±0,8 мВ на фоне нифедипина, то есть на 43% (p<0,05). Квантовый состав ПКП также возрастал от 10,4±1,4 до 15,8±1,9 под действием нифедипина (n=69, p<0,05).

Для понимания особенностей действия нифедипина были построены гистограммы амплитудного распределения ПКП. На рисунке 2 видно, что гистограмма амплитудных распределений ПКП новообразованных синапсов имеет асимметричную, скошенную форму – у нее имеется «хвост» высокоамплитудных ПКП. Такой вид гистограммы характерен для ранних стадий иннервации мышечных волокон, когда имеет место полисинаптическая полиаксональная иннервация мышечных волокон и вклад в регистрируемый интегральный ПКП нескольких активных синаптических контактов.

Рис. 1. Усредненные оригинальные записи ПКП. Каждая кривая - усреднение 50 ПКП, зарегистрированных в одном синапсе. а) Сравнение параметров одиночных ПКП интактных синапсов и синапсов на 11 сутки после пережатия нерва. б) Влияние нифедипина на амплитуду ПКП новообразованных синапсов на 11 сутки после пережатия нерва.

Оказалось, что под действием нифедипина происходит не только сдвиг всей гистограммы в область высокоамплитудных значений, но и изменение ее формы - увеличение дисперсии сигналов и, как правило, достоверное присутствие двух амплитудных пиков (рис. 2). Это позволяет предполагать, что сосуществующие на одном волокне терминали и синапсы функционально гетерогенны по своей чувствительности к нифедипину, а значит – и к входящему тормозному Са2+сигналу.

Рис. 2. Эффект нифедипина и агатоксина на нормированные гистограммы амплитудных распределений ПКП новообразованных синапсов. а) нифедипин, б) агатоксин.

Верапамил оказывал сходное действие на нервно-мышечную передачу в новообразованных синапсах. В контроле амплитуда ПКП составляла 5,9±0,7 мВ, а после аппликации верапамила – 8,6±0,9 мВ (p<0,05), то есть возросла на 45% (n=48). Квантовый состав же увеличился от 9,7±1,5 в контроле до 15,4±1,2 – на 58% (p<0,05).

Таким образом, различные по химическому строению антагонисты потенциал-чувствительных Cа2+-каналов L-типа оказывают сходный потенцирующий эффект на секрецию медиатора в новообразованных синапсах.

Это свидетельствует о специфичности их пресинаптического действия, связанного именно с блокадой Са2+-тока L-типа. Способность блокаторов Са2+каналов L-типа вызывать облегчение выброса медиатора в новообразованных синапсах мыши и лягушки описана и в ряде других работ (Tonge, 1974; Sugiura, Ko, 1997; Santafe et al., 2001).

Исследование спонтанной секреции АХ путем регистрации МПКП в новообразованных синапсах показало, что под действием нифедипина амплитуда МПКП достоверно не изменилась и составила 86,9±6,6 % от интактного контроля (p>0,05). Не наблюдалось также изменений и частоты МПКП на фоне действия нифедипина, что говорит о пресинаптическом действии блокаторов Са2+-каналов L-типа.

В интактных синапсах оба выбранных нами блокатора не вызвали достоверных изменений ни амплитуды, ни квантового состава ПКП. Так, квантовый состав ПКП в зрелых интактных синапсах в среднем составлял 34,15±5,5, а после аппликации нифедипина – 35,8±4,9 (n=45, p>0,05).

1.2. Влияние модуляции Са2+-каналов L-типа на вызванную ритмическую активность в интактных и новообразованных моторных синапсах.

Исследования ритмических залпов ПКП показали, что их рисунок в интактных и новообразованных синапсах существенно различается. В интактных синапсах вслед за коротким начальным облегчением развивается спад ПКП и выход на сниженный, но стабильный уровень – фазу «плато». В новообразованных же контактах имеет место продолжительное начальное облегчение передачи по ходу залпа, а средняя амплитуда ПКП на фазе «плато» превышает амплитуду первого ПКП в залпе (рис. 3).

Рис. 3. Влияние нифедипина и верапамила на амплитуду ПКП новообразованных и зрелых синапсов в коротком залпе. Данные приведены в процентах от первого ПКП в залпе. а) новообразованные синапсы, б) зрелые интактные синапсы.

Действие нифедипина на новообразованные синапсы привело к достоверному (р<0,05) подъему уровня фазы «плато» примерно на 20% - от 127,04±0,48% в контроле до 147,75±0,48% на фоне нифедипина (n=51) (рис. 3).

Под действием верапамила (5 мкМ) в новообразованных синапсах также происходило достоверное (р<0,05) увеличение средней амплитуды ПКП на фазе «плато» примерно на 29% - от 114,92±0,65% в контроле до 143,62±0,46% на фоне действия верапамила (n=48).

Исследования интактных мышечных волокон m.EDL показали, что в зрелых нервно-мышечных синапсах верапамил и нифедипин не оказывали достоверного влияния на параметры залповой активности. Так, например, в контроле уровень фазы «плато» был равен 80,52±0,28% от средней амплитуды ПКП1, а на фоне действия верапамила его значение составило 82,78±0,23% (n=57), то есть верапамил не привел к изменению этого функционально важного параметра залповой активности в интактных синапсах (рис. 3).

Итак, проведенные эксперименты показали, что присутствие блокаторов Са2+-каналов L-типа в омывающем нервно-мышечный препарат растворе вызывает ярко выраженное облегчение синаптической передачи при ритмической активности в новообразованных моторных синапсах m.EDL. В связи с этим, в следующей серии экспериментов мы решили проверить, как на синаптическую передачу в новообразованных синапсах повлияет воздействие, обратное блокаде L-типа кальциевых каналов - их активация.

«Отпирание» Са2+-каналов L-типа при помощи специфического агониста дигидропиридиновой природы S(-)-BAY K 8644 (искусственно удерживающего Са2+-канал в открытом состоянии) в концентрации 1 мкМ привела к тому, что уровень фазы «плато» достоверно снизился на 11,5% по сравнению с уровнем фазы «плато» в контроле (р<0,05). Так, в контроле значение уровня фазы «плато» составляло 169,81±0,73% от средней амплитуды ПКП1 в залпах, а при введении в опытный раствор ВAY К 8644 уровень «плато» снизился до 158,26±0,48% (n=48).

Это означает, что под действием активатора кальциевых каналов L-типа происходит подавление уровня выброса АХ при залповой активности новообразованных синапсов.

В зрелых интактных терминалях на фоне действия S(-)-ВAY К значение уровня фазы «плато» было значительно, достоверно (р<0,05) выше, чем в контроле: в контроле уровень «плато» составлял 69,2±0,87% от средней амплитуды ПКП1, а при введении в опытный раствор S(-)-ВAY К 8644 уровень «плато» поднялся до 90,46±0,95% (n=51).

Таким образом, только в новообразованных моторных синапсах мыши наблюдается облегчение выброса АХ при действии антагонистов Са2+-каналов Lтипа (нифедипина и верапамила) и торможение выброса АХ при действии агонистов Са2+-каналов L-типа (S(-)-ВAY К 8644). Причем Са2+-зависимое торможение секреции АХ проявляется лишь при вызванной – одиночной и ритмической – активности синапсов и не затрагивает спонтанную секрецию АХ.

Для понимания механизмов Са2+-зависимого торможения секреции АХ в новообразованных синапсах, важно было выяснить, участвует ли в нем лишь вход кальция по L-типу каналов, либо также и другие источники поступления кальция в терминаль, в частности – вход наружного кальция по потенциал-зависимым Са2+-каналам P/Q-типа, а также выброс депонированного кальция из рианодинчувствительных Са2+-депо терминалей.

1.3. Влияние блокады Са2+-каналов P/Q-типа на одиночную вызванную секрецию медиатора в интактных и новообразованных синапсах.

В интакных нервно-мышечных синапсах мыши основными потенциалактивируемыми Са2+-каналами, обеспечивающими вход триггерного кальция, запускающего секрецию медиатора, являются Са2+-каналы P/Q-типа (Uchitel et al., 1992). Их блокада за короткое время приводит к подавлению секреции медиатора на 90% (Katz et al., 1996). В новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши также описан пул потенциал-зависимых Са2+-каналов P/Q-типа. Какую роль играют эти каналы в период существования в терминалях Са2+-зависимого торможения секреции АХ - оставалось не ясным. Для решения этого вопроса мы исследовали изменения режима вызванной секреции АХ в новообразованных нервно-мышечных синапсах m.EDL мыши на фоне действия селективного блокатора Ca2+-каналов P/Q-типа омега-агатоксина в концентрации 70 нМ.

Добавление агатоксина в омывающий нервно-мышечный препарат раствор приводило в новообразованных синапсах к падению амплитуды ПКП в первые же 5 минут инкубации на 67%, от 7,05±1,18 мВ в контроле до 2,53±0,09 мВ (p<0,05).

Далее, на протяжении 40 минут амплитуда ПКП недостоверно колебалась в пределах 10% этого значения пока, наконец, к исходу часовой инкубации вызванный ответ на стимуляцию нерва вовсе не исчезал (n=51). При этом агатоксин не оказывал влияния на амплитуду МПКП новообразованных терминалей, что свидетельствует о пресинаптическом действии этого токсина.

Анализ гистограмм распределений амплитуд ПКП показывает, что асимметричная, имеющая «хвост» высокоамплитудных ПКП гистограмма, характерная для полисинаптического пула новообразованных контактов, после инкубации с агатоксином, резко сдвигается в сторону более низких амплитуд, приобретая компактную симметричную форму (рис. 2). Это свидетельствует о том, что агатоксин (в отличие от нифедипина) одинаково негативно повлиял на все популяции синапсов, сосуществующих на мышечном волокне. Следовательно, в новообразованных терминалях мыши вход кальция по каналам P/Q-типа направлен исключительно на обеспечение запуска Са2+-зависимой секреции АХ и не участвует в процессах Са2+-зависимого подавления выброса медиатора.

2. ВЛИЯНИЕ ДЕПОНИРОВАННОГО КАЛЬЦИЯ НА ВЫЗВАННУЮ СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ.

По данным литературы, в нейронах и других типах клеток вход кальция по L-типу Са2+-каналов часто сопряжен с выбросом депонированного кальция через рианодиновые рецепторы (РиР) (Sukhareva et al., 2002; Yu et al., 2007; Berrout, Isokawa, 2009). Роль системы депонированного кальция в новообразованных синапсах до сих пор никем не изучалась. Поэтому в следующей серии нашей работы мы изучали изменения одиночных ПКП и залповой активности новообразованных синапсов на фоне действия рианодина в концентрации 5 мкМ, вызывающей блокаду РиР и в концентрации 0,5 мкМ, приводящей к активации и удержанию РиР в открытом состоянии (Balezina, Bukiya, 2005).

2.1. Влияние рианодина на одиночную вызванную секрецию медиатора Аппликация рианодина в концентрации, блокирующей РиР и выброс депонированного кальция из пресинаптических Са2+-депо (5 мкМ), приводила к значительному увеличению амплитуды и квантового состава ПКП в новообразованных синапсах m.EDL. Так, квантовый состав ПКП в контроле равнялся 13.12±1,5, а после добавления рианодина (5 мкМ) поднялся до 22,36±3,(p<0,05), что составляет 170% от контроля (n=67). Амплитуда МПКП под действием рианодина не изменяется, что указывает на пресинаптический характер облегчающего действия этого реагента на амплитуду ПКП.

При добавлении в омывающий нервно-мышечный препарат раствор рианодина в низкой, активирующей РиР концентрации (0,5 мкМ), наблюдается прямо противоположный эффект. Квантовый состав ПКП снижается от 18,38±2,в контроле до 13,51±1,1 – то есть на 26% (p<0,05, n=61). На гистограмме амплитудных распределений ПКП виден симметричный сдвиг огибающей в сторону низких амплитуд под действием рианодина в концентрации 0,5 мкМ.

Амплитуда МПКП осталась при этом неизменной, благодаря чему мы можем считать данный тормозный эффект рианодина пресинаптическим, направленным на торможение квантового выброса АХ в новообразованных синапсах.

2.2. Влияние рианодина на залповую вызванную секрецию медиатора.

Введение в раствор Лайли рианодина в концентрации 5 мкМ привело к значительному повышению уровня фазы «плато» ПКП в ритмических залпах ПКП, регистрируемых в новообразованных синапсах m.EDL. Уровень фазы «плато» в залпе в контроле составил 174,16±1,49% от средней амплитуды ПКП1 и был достоверно (р<0,05) ниже значения уровня фазы «плато» на фоне действия рианодина 5 мкМ - 306,8±5,79% (n=58) (рис. 4).

Таким образом, «выключение» кальциевых депо, то есть Са2+зависимого выброса депонированного кальция, в новообразованных синапсах на ранних стадиях мышечной реиннервации привело к развитию хорошо выраженного облегчения выброса медиатора в условиях Рис. 4. Изменение амплитуды ПКП в ходе ритмической стимуляции нерва.

залповой активности новообразованных Добавление же рианодина в синапсов на фоне действия рианодина в низкой концентрации (0,5 мкМ) концентрации 5 и 0,5 мкМ. Данные приведены в привело к полному исчезновению % от первого ПКП в залпе.

продолжительного облегчения передачи в коротком залпе ПКП, наблюдавшемуся в контроле. На фоне действия 0,5 мкМ рианодина ярко выражено падение уровня «плато» в залпе. Если в контроле значение фазы плато составило 170,98±0,49% от средней амплитуды ПКП1, то при введении рианодина (0,5 мкМ) уровень фазы «плато» упал до значения 114,42±0,35% (n=63, р<0,05) (рис. 4).

В результате двух подходов – анализа эффектов блокады и активации РиР – нами получены взаимодополняющие и логически не противоречащие друг другу результаты. Они позволяют говорить о том, что в терминалях новообразованных моторных синапсов m.EDL мыши эффективно работает выброс депонированного кальция через РиР, который направлен на подавление секреции АХ. В связи с этим важно было выяснить, может ли выброс депонированного кальция запускаться при входе в терминаль кальция по L-типу каналов. Для ответа на этот вопрос мы проводили регистрацию и анализ одиночной вызванной активности новообразованных синапсов на фоне сочетанного действия нифедипина (10 мкМ) и рианодина (5 мкМ).

2.3. Изменение параметров вызванной активности новообразованных синапсов на фоне совместного действия нифедипина и рианодина.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»