WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Богачева Полина Олеговна Механизмы Са2+-зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервномышечных синапсах мыши 03.00.13 – физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова (заведующий – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский) НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова Ольга Петровна Балезина ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины МГУ им.

М.В.Ломоносова Владимир Борисович Кошелев доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории мембранологии с группой генетических исследований ГУ «Научный центр здоровья детей РАМН» Татьяна Павловна Сторожевых ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Российский Университет Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы

Защита диссертации состоится 9 ноября 2009 года в 1530 на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001.93 биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова по адресу:

119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 1 октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Б. А. Умарова 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Механизмы образования и перестройки синаптических контактов - актуальный вопрос современной синаптологии, ключ к пониманию пластичности нейронов. Классической моделью синаптогенеза являются процессы формирования и удаления нервно-мышечных синапсов, происходящие на скелетных мышечных волокнах млекопитающих в период реиннервации мышцы прорастающим к ней двигательным нервом после его повреждения (Bennett et al., 1973; Argentieri et al., 1992; Burden, 2002; Lomo, 2003). Известно, что подрастающие моторные аксоны образуют на волокне избыточное число контактов, из которых большинство вскоре «замолкают», то есть перестают секретировать медиатор, а вслед за этим отторгаются, элиминируются. В результате на волокне сохраняется один синапс, а полисинаптическая иннервация сменяется на одиночную, моносинаптическую. Механизмы и процессы, приводящие к подавлению избыточных синапсов и их последующей элиминации, остаются не ясными, несмотря на актуальность и длительную историю изучения вопроса (Hoh et al., 1975; O`Brien et al., 1978; O`Brien et al., 1984; Barber, Lichtman, 1999; Constanzo et al., 1999; Lanuza et al., 2002; Santafe et al., 2002; Nelson et al., 2003; Buffelli et al., 2004; Li et al., 2004).

В последние годы установлено, что в новообразованных моторных терминалях наряду с потенциал-зависимыми Са2+-каналами P/Q- и N-типа, запускающими секрецию медиатора, имеются потенциал-зависимые Са2+-каналы L-типа, принимающие особое участие в регуляции секреции медиатора (Atchison, 1989; Gray et al., 1992; Fu, Huang, 1994; Rosato-Siri, Uchitel, 1999). Показано, что именно вход кальция в терминали по L-типу Са2+-каналов (при генерации пресинаптического потенциала действия) приводит к подавлению секреции медиатора в новообразованных синапсах, их «замолканию» и, как следствие - последующей элиминации избыточных синапсов. Соответственно, блокаторы Са2+-каналов L-типа (D-600, нифедипин и др.), напротив, способствуют растормаживанию подавленных синапсов и усилению синаптической передачи в период новообразования нервно-мышечных синапсов (Rosato-Siri, Uchitel, 1999;

Santafe et al., 2001; Piriz et al., 2003). Явление Са2+-зависимого торможения секреции ацетилхолина (АХ) в новообразованных синапсах выявлено как в период реиннервации зрелых скелетных мышц, так и на ранних стадиях онтогенеза и формирования двигательной иннервации скелетных мышечных волокон. Высказываются предположения, что это торможение имеет отношение к подавлению активности избыточных синапсов и ускорению созревания моторной иннервации в виде одиночной концевой пластинки (Santafe et al., 2002).

Механизмы Са2+-зависимого торможения секреции АХ в моторных синапсах в период их новообразования на скелетных мышечных волокнах остаются не изученными и представляют большой интерес для нервно-мышечной физиологии и клинической неврологии.

Цели и задачи работы. Целью работы было изучить внутриклеточные механизмы, с помощью которых ионы кальция, поступающие в новообразованные нервные терминали по L-типу Са2+-каналов, приводят к подавлению секреции медиатора и передачи сигналов в новообразованных моторных синапсах реиннервируемых скелетных мышц мыши.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать явление Са2+-зависимого торможения секреции АХ с помощью агонистов и антагонистов Са2+-каналов L-типа, его особенности на разных сроках созревания синапсов, при ритмической залповой и спонтанной активности новообразованных контактов.

2. Выявить вклад депонированного кальция, выбрасываемого через рианодиновые рецепторы (РиР) терминалей, в Са2+-зависимое торможение секреции АХ в новообразованных синапсах.

3. Исследовать участие Са2+-зависимых К+-каналов большой и малой проводимости (ВК- и SK-типа) в реализации Са2+-зависимого торможения секреции АХ в новообразованных моторных терминалях 4. Выявить участие ряда Са2+-зависимых белков и ферментов – кальмодулина, кальмодулинкиназы II (CaMKII) и протеинкиназы С (PKС) в Са2+-зависимом торможении секреции АХ 5. Исследовать возможный вклад потенциал-активируемых К+v-каналов в Са2+зависимое торможение, осуществляемое с участием PKС.

Научная новизна полученных результатов.

В работе получен ряд новых ранее не известных фактов. Впервые показано, что Са2+-зависимое торможение секреции АХ в новообразованных нервномышечных синапсах мыши наблюдается не только при одиночной, но и при залповой вызванной активности синапсов, однако не затрагивает спонтанную секрецию медиатора. Впервые раскрыта роль кальция, входящего по L-типу Са2+каналов, в активации РиР и выбросе депонированного кальция, который также участвует в механизме Са2+-зависимого торможения секреции медиатора.

Выявлен ранее не известный факт, что подавление активности пресинаптической CaMKII может принимать участие в Са2+-зависимом торможении синаптической передачи в новообразованных моторных синапсах. Наконец, впервые показано, что механизм Са2+-зависимого торможения АХ включает Са2+-зависимую активацию PKС, направленную на усиление активности потенциал-зависимых К+v-каналов терминалей в новообразованных моторных синапсах мыши.

Теоретическое и практическое значение работы К числу фактов, имеющих общее теоретическое значение для физиологии синапсов, относится выявленный в работе внутриклеточный каскад реакций, приводящий к Са2+-зависимому торможению секреции медиатора в новообразованных моторных синапсах мыши. Показано, что входящий в терминали потенциал-активируемый Са2+-ток L-типа в комплексе с индуцированным им выбросом депонированного кальция, вызывают формирование Са2+–сигналов, реципрокно влияющих на активность Са2+зависимых ферментов терминали. Происходит: а) подавление облегчающего действия CaMKII на секрецию АХ; б) активация PKС, направленная на усиление работы потенциал-зависимых К+v-каналов терминали и угнетение секреции АХ в исследуемых синапсах. Таким образом, показана способность двух пресинаптических Са2+-активируемых ферментов по-разному регулировать секрецию АХ, в зависимости от характера повышения уровня кальция в нервных терминалях. Эти данные приближают нас к пониманию Са2+-зависимых механизмов регуляции синаптической пластичности в химических синапсах.

Результаты работы могут оказаться полезными при решении прикладных задач синаптологии: при разработке способов коррекции посттравматических перестроек периферических нервно-мышечных синапсов, для ускорения восстановления иннервации мышц.

Основные положения работы, выдвигаемые на защиту 1. В новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши Са2+-зависимое торможение секреции АХ осуществляется с участием сочетанной активности Са2+-каналов L-типа и выброса депонированного кальция через РиР в составе моторных нервных терминалей.

2. Механизм Са2+-зависимого торможения секреции АХ предусматривает подавление потенцирующего действия CaMKII на выброс медиатора и синаптическую передачу в новообразованных синапсах мыши.

3. Вход кальция по L-типу Са2+-каналов приводит к активации Са2+-зависимой PKС, мишенью которой являются потенциал-активируемые К+v- каналы.

Усиление активности К+v-каналов, опосредуемое PKС, является одним из механизмов Са2+-зависимого торможения секреции в новообразованных синапсах мыши.

Апробация диссертации Результаты исследования были представлены на международной молодежной конференции Ломоносов-2007 (Москва, 2007), XX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), I Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов Симбиоз, Россия 2008 «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008), I Всероссийской (XVI) молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008), 6-ом Форуме Федерации Европейских Нейронаук (Женева, Швейцария, 2008), 38-ом ежегодном съезде Общества Нейронаук (Вашингтон, США, 2008), конференции с международным участием «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций», посвященной памяти Т.М. Турпаева (Москва, 2009), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), ежегодном съезде Британского Физиологического Общества «Физиология 2009» (Дублин, Ирландия, 2009).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в их числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текста.

Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристик материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы; иллюстрирована 53 рисунками. Список литературы включает 306 источников, из них 24 отечественных.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для исследования спонтанной и вызванной синаптической активности в интактных и новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши были выбраны моторные синапсы мышцы – длинного разгибателя пальцев m. extensor digitorum longus (m.EDL) мыши. Данная мышца иннервируется аксонами малоберцового нерва n. peroneus communis. В работе использовали беспородных мышей массой 20-30 г.

Пережатие нерва. Пережатие малоберцового нерва проводили за 11 суток до электрофизиологического эксперимента под эфирным наркозом. Раздавливание нерва осуществляли при помощи глазного пинцета с тонкими плоскими браншами, защищенными пластиковыми наконечниками, на расстоянии 4-5 мм от иннервируемой мышцы m.EDL. Протяженность раздавленного участка нерва составляла 1 мм. Разрез зашивали и обрабатывали 1% спиртовым раствором бриллиантовой зелени. Спустя 7-8 суток после операции наблюдали первые признаки восстановления иннервации мышцы проросшим к ней нервом.

Внутриклеточная регистрация спонтанных и вызванных потенциалов концевой пластинки. Для изучения активности новообразованных синапсов на сутки после пережатия нерва животных декапитировали и выделяли изолированный нервно-мышечный препарат. Для предотвращения мышечных сокращений в ответ на стимуляцию нерва проводили процедуру рассечения мышечных волокон (Barstad, Lilleheil, 1968). Полученный «рассеченный» нервномышечный препарат помещали в камеру, заполненную физиологическим раствором Лайли для теплокровных, содержащим 135 мM NaCl, 1,0 мM MgCl2, мM KCl, 0,9 мM NaH2PO4, 2,0 мM CaCl2, 11 мM глюкозы, 16 мM NaHCO3.

Раствор аэрировали карбогеном (96% О2, 4% СО2) до установления рН 7,2–7,4.

Исследования проводили при комнатной температуре (21). Миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) и потенциалы концевой пластинки (ПКП, не менее 50 в каждом синапсе) регистрировали внутриклеточно при помощи стеклянных микроэлектродов (сопротивление 5-10 МОм), заполненных 2,5 М раствором KCl. Для регистрации одиночных ПКП производили стимуляцию нерва импульсами длительностью 0,12-0,2 мм и частотой 0,3 Гц.

Амплитуда стимула подбиралась индивидуально в соответствии с особенностями каждого препарата. Для регистрации залповой активности синапсов использовали режим ритмической стимуляции нерва с частотой 50 Гц. Для одиночных ПКП анализировали среднюю амплитуду, квантовый состав (рассчитываемый как отношение средней амплитуды ПКП к средней амплитуде МПКП), параметры временного хода. При анализе ритмически генерируемых ПКП оценивали амплитуду фазы «плато» залпа по средней амплитуде 20 последних ПКП в залпе, выраженной в процентах от амплитуды первого ПКП в залпе.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Сравнение выборок производили по непараметрическому критерию Манна–Уитни.

Использовали уровень значимости отличий между двумя выборками, равный 0,05.

Все данные представлены как средние значения ± стандартные ошибки среднего, n - объем выборки (количество исследованных синапсов).

Используемые в работе вещества: нифедипин (Biomol); верапамил (SigmaAldrich); S(-)-BAY K 8644 (Biomol); рианодин (Biomol); омега-агатоксин (Biomol);

апамин (Sigma-Aldrich); паксиллин (Sigma-Aldrich); R-21574 (Serva); KN-(Biomol); хелеритрин (Sigma-Aldrich); бисиндолилмалейимид I (BIM) (SigmaAldrich); 4-аминопиридин (Biomol); бутандионмоноксим (BDM) (Biomol).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ Са2+-КАНАЛОВ L- И P/Q-ТИПА НА НЕРВНОМЫШЕЧНУЮ ПЕРЕДАЧУ В ИНТАКТНЫХ И РЕИННЕРВИРОВАННЫХ СИНАПСАХ Первая серия работы была посвящена анализу пресинаптических эффектов блокады Са2+-каналов L-типа в отношении секреции медиатора в интактных и новообразованных синапсах. Для блокады Са2+-каналов L-типа были выбраны разные по химическому строению избирательные блокаторы этих каналов:

нифедипин (10 мкМ), относящийся к дигидропиридинам, и верапамил (5 мкМ), принадлежащий к фенилалкиламинам. Исследования новообразованных моторных синапсов на волокнах m.EDL проводили на 11 сутки после пережатия малоберцового нерва.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»