WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 ||

Анализировали различия в подвижности обонятельных жгутиков вне действия одорантов до и после 12-минутной экспозиции в растворе ингибитора, а также под действием амилового спирта вне и на фоне действия ингибитора АЦ. В каждом эксперименте с ингибитором АЦ вели наблюдение за подвижностью обонятельных жгутиков на протяжении 30 мин.

Методики анализа движений обонятельных жгутиков. Для количественного анализа двигательной активности обонятельных жгутиков, во-первых, вели подсчет частоты их движений с помощью визуального анализа и секундомера. Анализировали подвижность отдельных жгутиков, находящихся в поле зрения. За одно колебание принималось перемещение жгутика из определенного положения в пространстве и его возврат в исходное положение. Для оценки достоверности различий между частотой движения вне действия и под действием одорантов использовали t-критерий Стьюдента. Во-вторых, характеризовали подвижность жгутиков с помощью специально разработанной компьютерной программы, которая позволяла улучшить качество видеоизображения, разбить его на кадры, вручную внести метку (черную точку в верхушку дистального отдела жгутика) в каждый отдельный кадр, собрать отдельные кадры в видеоряд и провести его автоматизированный анализ в реальном времени. Обрабатывали фрагменты видеозаписей продолжительностью 10 с до и после воздействия. Оценивали траекторию движения метки, спроецированную на оси X (рис. 1.1) и Y (рис. 1.2) в декартовой системе координат, а также в пространстве (рис. 1.3). Изменения подвижности оценивали на основе сравнения результатов обработки видеозаписей вне действия и под действием одоранта (рис. 1.3).

Разработанный нами метод компьютерного анализа позволил получить объективные данные о характере двигательной активности дистальных отделов обонятельных жгутиков в отсутствие пахучих веществ, а также о его изменении при воздействии одорантов на обонятельную выстилку.

Рис. 1.1. Траектория движения верхушки дистального отдела обонятельного жгутика лягушки вдоль оси Х Рис. 1.2. Траектория движения верхушки дистального отдела обонятельного жгутика лягушки вдоль оси Y Рис. 1.3. Траектории движения верхушки дистального отдела обонятельного жгутика лягушки вне действия одоранта (А) и под действием цинеола (Б) Результаты экспериментального исследования и их обсуждение Исследование двигательной активности обонятельных жгутиков вне действия одорантов показало, что обонятельные жгутики и земноводных (лягушки), и млекопитающих (крысы, кролика, человека) обладают подвижностью. При этом жгутики совершают неупорядоченные (в режиме рыскания) движения, в которых ведущее значение принадлежит их проксимальному отделу. В нем происходит активный процесс взаимодействия динеина с тубулином, а дистальный участок жгутика движется пассивно (подобно хлысту в руке погонщика). Диапазон частот двигательной активности обонятельных жгутиков лягушки вне действия одорантов ограничен 0,07 – 1,53 колебаниями в секунду, что соответствует 4 – 92 колебаниям в минуту. Среднее значение частоты движений жгутиков лягушки составило 0,52±0,колебаний в 1 с (31,2± 4,8 колебаний в 1 мин) (n=62).

Под влиянием амилового спирта, цинеола, ванилина и камфоры двигательная активность жгутиков изменялась. При этом на стимуляцию реагировали не все, а только некоторые обонятельные жгутики, в среднем, в 60% опытов. Вероятно, это связано с наличием у них мембранных рецепторов к данному одоранту, поскольку известно, что каждая обонятельная клетка экспрессирует только один тип обонятельного рецептора и способна отвечать на ограниченное число одорантов (Chess et al., 1994; Buck, 1995; Shykind, 2005).

Изменение характера подвижности обонятельных жгутиков под действием одорантов I группы проявлялось в том, что отдельные жгутики (в 15% опытов под действием амилового спирта, в 35% - под действием ванилина, в 39% - под действием камфоры, в 44% - под действием цинеола) выпрямлялись и удерживались в вытянутом положении (рис. 2). Длительность реакции вытягивания обонятельных жгутиков под действием одорантов, как правило, не превышала 2 – 3 с, иногда наблюдалось несколько последовательных выпрямлений с периодами учащенных движений между ними в течение нескольких секунд. Таким образом, неупорядоченные движения, присущие жгутикам в отсутствие пахучих веществ (рис.

2.А), под действием их приобретали упорядоченный характер (рис. 2.Б).

Упорядочение двигательной активности под влиянием одорантов было свойственно обонятельным жгутикам не только земноводных (лягушки), но и млекопитающих (крысы) (рис. 3).

Посредством конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии показано, что процесс упорядочения обонятельных жгутиков под действием одорантов может быть связан с реорганизацией цитоскелета и обеспечивается полимеризацией Gактина в F-актин (Бигдай, 2004). Взаимодействуя с миозином, идентифицированным в жгутиках обонятельных клеток (Wolfrum et al., 1998), F-актин может обеспечивать направленную на стимул двигательную реакцию обонятельных жгутиков. Известно, что у одноклеточных организмов и лейкоцитов взаимодействие хемоаттрактантов с мембранными рецепторами инициирует перестройку цитоскелета и обеспечивает направленный хемотаксис в градиенте концентрации молекул-аттрактантов (Bokoch, 2003). По-видимому, и в обонятельных жгутиках стимуляция пахучими веществами запускает цепь внутриклеточных реакций с участием посредников, которая обеспечивает реорганизацию цитоскелета и упорядочение жгутиковых движений.

Вероятно, такая реакция способствует настройке обонятельных клеток на восприятие молекул одорантов и направлена на их эффективное улавливание.

Рис. 2. Траектории движения верхушки дистального отдела жгутика лягушки вне действия одоранта (А) и под действием цинеола (Б).

Рис. 3. Траектории движения верхушки дистального отдела жгутика крысы вне действия одоранта (А) и под действием амилового спирта (Б) Под действием одорантов I группы у 60 – 70% обонятельных жгутиков лягушки, изменявших подвижность под их влиянием, частота движений повышалась (табл. 1). Изменения частоты движений жгутиков начинались через 5 – 10 с после воздействия одорантом и регистрировались в среднем на протяжении 15 - 20 с.

Таблица 1. Учащение колебаний жгутиков под действием одорантов Средняя частота Средняя частота Одорант колебаний вне действия колебаний под действием одоранта, с-1 одоранта, с-Амиловый спирт (n=25) 0,63±0,08 0,90±0,12* Цинеол (n=11) 0,44±0,07 0,85±0,13* Камфора (n=14) 0,61±0,09 0,86±0,Ванилин (n=8) 0,42±0,19 0,70±0,Примечание: * - различия достоверны по сравнению с частотой колебаний вне действия одоранта при р<0,05 (t-критерий Стьюдента).

Рис. 4. Учащение колебаний обонятельных жгутиков, с условно низкой (1), средней (2) и высокой (3) начальной частотой движений - частота колебаний обонятельных жгутиков вне действия одорантов - частота колебаний обонятельных жгутиков под действием одорантов I группы Различия достоверны по сравнению с частотой колебаний вне действия одорантов: 1 - при р<0,001; 2 - при р<0,001; 3 - при р<0,01 (t-критерий Стьюдента).

Данные учащения движений жгутиков под действием амилового спирта, цинеола, камфоры и ванилина были объединены (n=62) и разделены по частоте двигательной активности жгутиков на группы с (1) условно низкой (0,26±0,02), (2) средней (0,56±0,02) и (3) высокой (1,09±0,09) начальной частотой (рис. 4). По сравнению с результатами статистической обработки данных по каждому одоранту выделение их в 3 группы выявило более высокую достоверность различий частотного параметра в отсутствие и под действием одорантов.

Исследования мерцательного эпителия млекопитающих и земноводных показали, что учащение биения ресничек обусловлено повышением [Ca2+]i (Lieb, 2002; Zhang, 2003). Вместе с тем установлено, что под действием одорантов в обонятельных жгутиках повышается концентрация ионов Са2+, поступающих из внеклеточной среды (Бигдай, Самойлов, 2004; Restrepo et al., 1993; Nakamura et al., 1994; Schild et al., 1995; Leiders-Zufall et al., 1997). Можно предположить, что увеличение частоты движений обонятельных жгутиков, инициируемое пахучими веществами, связано с повышением [Ca2+]i.

Под действием одоранта II группы аммиака (10-4-10-3М) в 64% опытов частота движений обонятельных жгутиков увеличивалась с 0,52±0,08 до 0,87±0,11 (n=15) (различия достоверны при р<0,05, t-критерий Стьюдента). При концентрации аммиака 10-3М свою подвижность изменяли почти все жгутики, находившиеся в поле зрения, многие жгутики испытывали вибрацию (дрожание) и после 5 – 14 мин вибрации останавливались.

Показано, что аммиак легко проникает через мембрану и оказывает непосредственное влияние на метаболизм нервных клеток (Венедиктова и др., 2001;

Косенко и др., 2001). Он индуцирует открытие неспецифических ионных каналов во внутренней мембране митохондрий (Венедиктова и др., 2001), обладающих большой кальциевой емкостью. С другой стороны, аммиак ингибирует дыхательную цепь митохондрий (Косенко и др., 2001; Бигдай, 2004; Руденко, 2007), что приводит к снижению продукции АТФ и затруднению выведения Ca2+ из цитозоля во внеклеточную среду. По-видимому, повышение внутриклеточной концентрации Ca2+ и дефицит АТФ оказывали влияние на движения жгутиков, которые под влиянием аммиака вначале вибрировали, затем замедлялись и останавливались.

Известно, что увеличение частоты биения ресничек мерцательного эпителия лягушек связано с Са2+-зависимой активацией протеинкиназы С (Salathe, 2007), а ресничек мерцательного эпителия человека – с Са2+-индуцированной стимуляцией аденилатциклазы, последующей продукцией цАМФ и активацией протеинкиназы А (Lieb, 2002; Zhang, 2003). Мы предположили, что учащение движений обонятельных жгутиков в ответ на амиловый спирт может обусловливаться участием АЦ, так как она участвует в его трансдукции (Бигдай, 2004).

Для проверки этого предположения мы ингибировали АЦ 3’5’дидеоксиаденозином и обнаружили, что ее выключение в 90% опытов изменяло частоту двигательной активности обонятельных жгутиков. Это означает, что АЦ участвует в обеспечении подвижности обонятельных жгутиков лягушки вне действия одорантов. В то же время снижение активности АЦ не блокировало двигательных реакций упорядочения и учащения обонятельных жгутиков, стимулированных амиловым спиртом.

Из результатов наших опытов следует, что аденилатциклазная система участвует в регуляции неупорядоченного движения обонятельных жгутиков, происходящего благодаря взаимодействию тубулина с динеином в отсутствие одорантов. Вместе с тем АЦ не участвует в упорядочении их двигательной активности под действием обонятельных стимулов, которое обеспечивается актинмиозиновой системой подвижности. Можно предположить, что в обонятельную трансдукцию амилового спирта, с одной стороны, и реорганизацию жгутикового цитоскелета, инициируемую этим одорантом для возникновения упорядоченных движений, - с другой стороны, вовлекаются разные внутриклеточные сигнальные системы.

Результаты нашей экспериментальной работы подтверждают гипотезу о том, что подвижность является универсальным свойством обонятельных жгутиков земноводных (лягушки) и млекопитающих (крысы, кролика), включая человека.

Исследование показало, что характер двигательной активности обонятельных жгутиков под действием одорантов изменяется. Жгутиковые движения упорядочиваются. Кроме того, повышается их частота. С помощью разработанного метода компьютерного анализа подвижности обонятельных жгутиков впервые обнаружено, что процесс упорядочения движений жгутиков под действием одорантов протекает аналогично у земноводных (лягушек) и млекопитающих (крыс). В этом упорядочении АЦ не участвует.

Выводы 1. Подвижность является универсальным свойством обонятельных жгутиков представителей земноводных (лягушек) и млекопитающих (крыс, кроликов) животных, а также человека.

2. В отсутствие одорантов обонятельные жгутики и земноводных (лягушек), и млекопитающих (крыс, кроликов) животных, а также человека, совершают неупорядоченные движения в режиме рыскания.

3. Под действием одорантов двигательная активность обонятельных жгутиков упорядочивается, что было выявлено как визуально, так и посредством разработанного нами метода компьютерного анализа.

4. Одоранты изменяют не только траекторию, но и частоту движений обонятельных жгутиков. Под действием одорантов частота колебаний большинства обонятельных жгутиков лягушки увеличивается.

5. Аденилатциклаза принимает участие в обеспечении двигательной активности обонятельных жгутиков лягушки, но только вне действия одорантов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Влияние одорантов на цитоскелет ресничек обонятельных клеток / Е.В. Бигдай, В.О. Самойлов, В.В. Бекусова // Морфология (Архив анатомии, гистологии и эмбриологии). - 2006. - Т.129. - № 2. - С. 21.

2. Прижизненная телевизионная микроскопия жгутиков обонятельных клеток земноводных и млекопитающих / В.В. Бекусова, Е.В. Бигдай // Материалы научного совещания «Актуальные проблемы учения о тканях». - СПб: ВМедА, 2006. – С. 18.

3. Прижизненная телевизионная микроскопия жгутиков обонятельных клеток земноводных и млекопитающих. Методика анализа движения / В.В. Бекусова, В.В.

Дубовик // Труды международной научной конференции «Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Метромед 2007».- СПб: Политехн.

Универс., 2007. - С. 34-35.

4. Две молекулярные системы подвижности обонятельных жгутиков лягушки / Е.В. Бигдай, В.О. Самойлов, Я.Н. Руденко, В.В. Бекусова, Б.А. Дудич // Биофизика. - 2008. - Т. 53. вып. 6. - С. 997–1000.

5. Исследование двигательной активности обонятельных жгутиков под действием одорантов / В.В. Бекусова, Е.В. Бигдай // VI Сибирский физиологический съезд.

Тезисы докладов - Барнаул: Принтэкспресс, 2008. - В 2 томах. Т.1. - С.164-165.

6. Two molecular motility systems of frog olfactory cilia / E.V. Bigdai, V.O. Samoilov, J.N. Rudenko, V. Bekusova, B.A. Dudich // Biological Motility: achievements and perspectives (Eds. Z.A. Podlubnaya and S.L. Malyshev).-Pushino: Foton-Vek, 2008. - Vol.2. - P.207-209.

7. Молекулярные и субклеточные механизмы биологической подвижности в висцеральных и сенсорных системах / Е.В. Бигдай, В.О. Самойлов, Захарова Г.П., Шабалин В.В., Панов С., В.В. Бекусова // VII Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 160-летию со дня рождения И.П. Павлова «Механизмы функционирования висцеральных систем». – СПб: ИФ им. И.П. Павлова РАН. -2009. - С. 386-387.

8. Молекулярные механизмы биомеханических процессов в обонятельных жгутиках / Е.В. Бигдай, В.О. Самойлов, В.В. Бекусова // Материалы XIII Всероссийской конференции по проблемам науки и высшей школы. 18 мая 2009 г.

Pages:     | 1 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»