WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 |
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

БЕКУСОВА Виктория Витальевна ДВИГАТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ОБОНЯТЕЛЬНЫХ ЖГУТИКОВ ЗЕМНОВОДНЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ 03.03.01 – физиология 03.01.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010 2

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии ВМедА им. С.М. Кирова Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Самойлов Владимир Олегович доктор биологических наук, доцент Бигдай Елена Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Лапицкий Виктор Петрович доктор биологических наук, профессор Крылов Борис Владимирович

Ведущая организация: Институт цитологии

Защита состоится « 18 » марта 2010 г в 16 часов на заседании Совета Д212.232.10 по защите докторских и кандидатских диссертаций при СанктПетербургском государственном университете по адресу 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, ауд. 90

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького СанктПетербургского государственного университета

Автореферат разослан « » 2010 г

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор биологических наук, профессор Н.П. Алексеев 3 Общая характеристика диссертации Актуальность проблемы. Изучение механизмов восприятия обонятельных стимулов на уровне периферического (рецепторного) отдела обонятельной сенсорной системы является актуальной проблемой современной физиологии и биофизики, имеет важное значение для медицины, парфюмерии, сельского хозяйства, экологии и бионики. Знание особенностей структуры и функционирования обонятельных клеток необходимо для активного вмешательства при некоторых патологических состояниях органов обоняния, в частности, при аносмиях, регуляции эмоционального состояния и управления поведением животных и человека. Биофизические механизмы узнавания запахов могут быть основой для создания искусственных обонятельных сенсоров при конструировании приборов химического анализа.

Кодирование количественных и качественных параметров обонятельных стимулов обеспечивается различными комбинациями рецепторных клеток обонятельного эпителия, контактирующих с внешней средой посредством подвижных жгутиков (Buck, Axel, 1991). Литературных данных, касающихся исследования подвижности обонятельных жгутиков, крайне мало. Изучению этой проблемы посвящены работы Бронштейна А.А. в 1970-е годы, Mair et al. (1982), Трущенкова В.Г. (1995), Бигдай Е.В. (2004, 2005, 2006), Самойлова В.О. и сотр. (1999 - 2009).

Полагают, что двигательная активность обонятельных жгутиков обеспечивает активный поиск и обнаружение молекул пахучих веществ (Винников, 1965), способствует контакту с молекулами одорантов, вовлечена в процессы десорбции этих молекул из участков их связывания на мембране жгутиков (Бронштейн, 1966).

Одни авторы считают подвижность обонятельных жгутиков универсальной для всех позвоночных (Бронштейн, 1977; Бигдай, Самойлов, 2004, 2006), по мнению других, – они неподвижны (Ronnett, Moon, 2002; Satir, 2007), третьи полагают, что подвижность присуща только жгутикам амфибий, а у млекопитающих они неподвижны (Moran, 1983; Schild, Restrepo, 1998). Таким образом, мнения о самом факте подвижности обонятельных жгутиков разноречивы, и ясности в этом вопросе нет.

Прижизненная микроскопия высокого качества свидетельствует об упорядочении двигательной активности обонятельных жгутиков под действием различных пахучих веществ (Бигдай, 2004; Бигдай, Самойлов, 2006; Руденко, 2007).

Эти изменения не в достаточной степени охарактеризованы количественно и имеют преимущественно описательный характер.

Таким образом, вопросы о наличии подвижности обонятельных жгутиков у млекопитающих, включая человека, и об изменении характера двигательной активности жгутиков под действием одорантов остаются открытыми.

Существует предположение, что подвижность обонятельных жгутиков играет важную роль в обеспечении необычайно высокой чувствительности обонятельного анализатора. Вклад изменений двигательной активности обонятельных жгутиков в нарушения обоняния не исследован. Остаются неизвестными причины аносмии при диабете (Dennis et al., 2005), синдроме Дауна (Chen et al., 2006), болезнях Паркинсона и Альцгеймера (Hawkes, 2003), паросмии и гипосмии при химиотерапии (Muller et al., 2006), вследствие приема некоторых лекарственных препаратов (Doty et al., 2004), депрессиях (Lombion-Pouther et al., 2005). Мы полагаем, что изучение подвижности обонятельных жгутиков в исследованиях патологии обоняния остается без внимания потому, что обонятельные жгутики млекопитающих животных, а также человека считаются неподвижными.

Для изучения роли двигательной активности обонятельных жгутиков в рецепции одорантов необходимо, прежде всего, выяснить, обладают ли жгутики обонятельных клеток различных позвоночных, включая человека, подвижностью и исследовать изменения их двигательной активности под действием пахучих веществ.

Цель исследования: изучить характер двигательной активности обонятельных жгутиков представителей земноводных (лягушки) и млекопитающих (крысы, кролика) животных, а также человека.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить характер двигательной активности обонятельных жгутиков земноводных (лягушки) и млекопитающих (крысы, кролика) животных, а также человека вне действия одорантов.

2. Исследовать характер двигательной активности обонятельных жгутиков земноводных (лягушки) и млекопитающих (крысы, кролика) животных под действием одорантов.

3. Проанализировать различия в подвижности обонятельных жгутиков вне действия одорантов и под их влиянием при помощи разработанной нами методики компьютерного анализа двигательной активности.

4. Изучить участие аденилатциклазы в движениях обонятельных жгутиков вне действия и под действием амилового спирта.

Научная новизна. Впервые с помощью прижизненной телевизионной микроскопии зарегистрирована двигательная активность жгутиков обонятельных клеток млекопитающих животных (крысы и кролика), а также человека. Установлено, что обонятельные жгутики и лягушки, и млекопитающих (крысы, кролика, человека) вне действия одорантов совершают неупорядоченные движения в режиме рыскания.

Разработана новая методика компьютерного анализа двигательной активности отдельных обонятельных жгутиков, с помощью которой удалось объективно оценить упорядочение их двигательной активности в ответной реакции на одоранты у представителей земноводных (лягушки) и млекопитающих (крысы). Впервые проведена количественная оценка изменения частоты движений обонятельных жгутиков под действием одорантов.

При изучении реакций на амиловый спирт с использованием 3’5’дидеоксиаденозина, специфического ингибитора аденилатциклазы, впервые выявлено участие аденилатциклазы в двигательной активности обонятельных жгутиков лягушки только вне действия одорантов.

Теоретическая и практическая значимость. Работа имеет теоретическое значение для развития физиологии и биофизики обонятельной сенсорной системы, так как углубляет и расширяет представление о роли подвижности жгутиков обонятельных клеток в реакциях на одоранты.

Данные о неупорядоченной двигательной активности обонятельных жгутиков земноводных (лягушки) и млекопитающих (крысы, кролика, человека) вне действия обонятельных стимулов и об упорядочении их движений под влиянием одорантов свидетельствуют о единообразии биомеханических процессов в обонятельных клетках представителей разных классов позвоночных животных, а также человека.

Теоретические положения и выводы из работы могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах физиологии и биофизики в высших учебных заведениях медицинского и биологического профилей, а также в разработке новых моделей высокочувствительных искусственных сенсоров и преподавании этих вопросов в технических вузах.

Исследование роли двигательной активности обонятельных жгутиков в обонятельной рецепции позволит глубже вникнуть в патогенез различных форм патологии обоняния, 90% которых, как известно (Овчинников, 1999), связаны с нарушением функционирования рецепторного аппарата обонятельного анализатора.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на Рабочем совещании «Биомеханика-2005» (Санкт-Петербург, 2005), XIX Всероссийском научном совещании «Актуальные проблемы учения о тканях» (Санкт-Петербург, 2006), Международной конференции «МЕТРОМЕД 2007» (Санкт-Петербург, 2007), Международном симпозиуме «Biological motility» (Пущино, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), XIII Всероссийской конференции по проблемам науки и высшей школы «Фундаментальные исследования и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2009), VII Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (СанктПетербург, 2009).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методик и результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, в число которых входят 8 таблиц и 40 рисунков. Список литературы включает 261 источник: 48 – на русском и 213 – на иностранных языках.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Подвижность является универсальным свойством обонятельных жгутиков представителей земноводных (лягушек) и млекопитающих (крыс, кроликов) животных, а также человека. В отсутствие одорантов обонятельные жгутики совершают неупорядоченные движения в режиме рыскания. Под действием одорантов двигательная активность обонятельных жгутиков упорядочивается.

2. Одоранты изменяют не только траекторию, но и частоту жгутиковых движений, причем частота колебаний большинства обонятельных жгутиков лягушки увеличивается.

3. Аденилатциклаза принимает участие в обеспечении двигательной активности обонятельных жгутиков лягушки, но только вне действия одорантов.

Материалы и методы Приготовление препаратов. Опыты проводили на изолированной обонятельной выстилке самцов лягушки Rana temporaria, белых беспородных лабораторных крыс и кроликов. Кроме того, исследовали обонятельный эпителий человека, взятый при аутопсии. Обонятельный эпителий 3 человек (2 мужчин и женщины) был взят и предоставлен нам для исследования судмедэкспертом на разных сроках после наступления смерти – через 30 часов, 42 и 83 часа. Под бинокулярным микроскопом отделяли обонятельный эпителий от костной и хрящевой основы и изготавливали тонкие срезы. Каждый срез обонятельного эпителия помещали в каплю раствора Рингера (для холоднокровных), Локка (для теплокровных), 199-ю среду (для человека) боковой поверхностью на предметное стекло. Затем фиксировали его сверху покровным стеклом с помощью подложек из пластилина, которые препятствовали сдавливанию препарата и обеспечивали проток жидкости над препаратом и возможность его стимуляции.

Методика прижизненной телевизионной микроскопии. Препараты размещали на предметном столике светового микроскопа ЛЮМАМ И 3 (ЛОМО). В качестве источника освещения использовали галогеновую лампу (9В, 70 Вт). В исследованиях использовали объектив 40х/0,65 (без иммерсии), фотонасадку МФН-2,5х и видеоконтрольное устройство, что обеспечивало общее увеличение до крат. Изображение объекта регистрировали видеокамерой КРС-300С. Разрешающая способность установки составляла 0,1 мкм. Это позволило различать отдельные обонятельные жгутики на препаратах обонятельной выстилки и наблюдать их движение. Регистрацию двигательной активности обонятельных жгутиков проводили, передавая изображение с видеокамеры посредством платы ввода видеоизображения Studio DC 10 plus фирмы Pinnacle Systems Inc на жесткий диск персонального компьютера с процессором Intel Celeron 2000 МГц. Эта плата оцифровывает сигнал в стандарте PAL при разрешении 720х540 пикселей и частоте 25 кадров в 1 с.

Регистрацию двигательной активности обонятельных жгутиков проводили непрерывно в течение 3 мин: 1 мин вне действия одорантов, затем 30 с в момент и после контрольного воздействия каплей раствора Рингера, затем – 1,5 мин в момент и после воздействия каплей раствора одоранта.

Методика стимуляции обонятельной выстилки. Для стимуляции использовали растворы в этиловом спирте природной тертой d-камфоры («Реахим») (камфорный запах), цинеола («Molecular Probes», США) (запах душистого эвкалипта), амилового спирта («Реахим») (прогорклый запах), ванилина («Molecular Probes», США) (цветочный запах) и водный раствор аммиака («Реахим») (острый запах).

Пахучие вещества были разделены на две группы на основании особенностей молекулярного механизма их трансдукции (Бигдай, 2004). Одорантами I группы, вовлекающими в рецепцию внутриклеточные сигнальные системы, были амиловый спирт, цинеол, камфора и ванилин. Представителем II группы одорантов, непосредственно проникающих в обонятельные клетки, был аммиак.

Использовали надпороговые концентрации пахучих веществ (10-6-10-5М), которые оказывали заметное влияние на двигательную активность обонятельных жгутиков. Поскольку в наших опытах аммиак не оказывал заметного влияния на двигательную активность жгутиков в концентрациях 10-6-10-5М, его действие исследовали в более высоких концентрациях – 10-4-10-3М. На каждый препарат обонятельной выстилки действовали сначала раствором Рингера (Локка) и затем однократно раствором одного из одорантов. Оба раствора подавали в проток под покровное стекло с помощью дозатора А20 мкл (объем контрольного и стимулирующего растворов - 5 мкл). Для каждого пахучего вещества применяли одноразовую съемную насадку на дозатор.

Фармакологический анализ двигательной активности обонятельных жгутиков. Для выяснения роли аденилатциклазы (АЦ) в двигательной активности обонятельных жгутиков проводили фармакологический анализ с использованием 3’5’-дидеоксиаденозина («Molecular Probes», США), специфического ингибитора АЦ, который подводили к препарату так же, как и одоранты. Мы стимулировали обонятельные жгутики амиловым спиртом вне и на фоне действия ингибитора АЦ, так как показано, что АЦ участвует в трансдукции амилового спирта (Бигдай, 2004).

Pages:     || 2 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»