WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

В первой серии измерений определяли изотопное отношение углерода печени, почки, сердца и мышечной ткани каждого из четырех эмбрионов 20-ой стадии развития. Во второй серии измерений, проведенных на эмбрионах той же стадии, помимо 13С определяли процентное содержание углерода, азота и изотопное отношение азота. В этой серии измерений в одном образце объединяли однотипные ткани от восьми эмбрионов.

У плодов на стадии 22 – 23 (18-19 день беременности, 1-2 дня до рождения) увеличивается число органов с массой, достаточной для массспектрометрического анализа и становится возможным определение пола плодов. В первой серии измерений тканей трех единоутробных плодов стадии развития определяли только изотопное отношение углерода. Во второй серии также определяли 13С в образцах, объединяющих ткани четырех плодов женского и четырех плодов мужского пола на 22-ой стадии развития.

В третьей серии измерений, помимо 13С, определяли процентное содержание углерода, азота и изотопное отношение азота в образцах, объединяющих однотипные ткани четырех плодов женского пола и пяти плодов мужского пола на 22-ой стадии развития.

Приготовление образцов для масс-спектрометрического анализа. Извлеченные из организма ткани и органы тщательно очищали от прилегающих тканей и отмывали от крови (до полного прекращения отделения крови в надсеченных паренхиматозных органах) в нескольких сменах физиологического раствора (для теплокровных или холоднокровных, в соответствии с видом). Мягкие ткани измельчали до гомогенной массы. Нити сухожилий хвоста разрезали на мелкие части; фрагменты костей дробили. Полученные образцы высушивали в термостате при температуре +65°С в течение 2-3 суток.

Высушенные образцы перетирали в фарфоровой ступке до мелкодисперсного порошка. Из сохранявшихся при низкой температуре тканей 1- и 22месячных мышей выделяли три основные биохимические фракции: белки, жиры и нуклеиновые кислоты, модифицировав для этой цели известный метод Мармура (Северин, Соловьева, 1989).

Полученные образцы тканей и высушенные фракции тканей (от отдельных особей, либо после смешения в равных весовых долях) развешивали по 0,3 – 0,5 мг в оловянных капсулах для масс-спектрометрического анализа (Thermo, Finnegan, Италия), которые немедленно запечатывали и держали до момента анализа в эксикаторе с силикагелем.

Масс-спектрометрические измерения. Собственно измерения производили plus на двух устройствах: масс-спектрометре “ Finnigan DELTA ” (Институт геохимии и аналитической химии РАН), на котором определяли только изотопное отношение углерода, и “Thermo-Finnigan DELTA V plus” (Институт проблем эволюции экологии РАН), который позволяет одновременное определение изотопного отношения углерода, азота, так же как процентного содержания этих элементов в образцах.

Изотопные отношения (13C/12C, N/14N) выражаются величиной, представляющей собой отклонение изотопного состава (обычно в промилле, ‰) образца (Rобр) от изотопного состава некоторого вещества, принятого в качестве стандарта (Rст):

R - R = 103.

R В качестве стандарта для определения 13С повсеместно принят углерод образца кальцита окаменелости Belemnitella americana формации P-D (Южная Каролина, США) мелового периода – PDB (Pee-Dee Belennite), в котором Rст равен 11,237·10-3. Стандартом при изотопном анализе азота служит азот воздуха, для которого Rст = 3,676·10-3. Возрастание величины свидетельствует о повышении доли малораспространенного изотопа, а снижение, – соответственно, о повышении доли распространенного изотопа элемента в образце.

Статистическая обработка полученных данных. Для оценки полученного в результате измерений числового материала использовали методы статистического анализа: для определения однородности или гетерогенности выборок – однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA); для сравнения отдельных выборок данных – непараметрические критерии Ван дер Вардена, Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни; для выяснения различий между однотипными компонентами выборок – LSD (Least Squire Deviation) – тест, эквивалентный t-критерию для независимых переменных. Корреляционные связи переменных оценивали с помощью непараметрического метода Спирмена, а функциональные связи переменных – методом регрессионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изотопное отношение тканей рыб Распределение значений 13С (первая серия измерений) в соответствии с типом тканей самок и самцов иллюстрирует на рис. 1, А. Однофакторный дисперсионный анализ (группирующий фактор – тип ткани) свидетельствует о значимой (p=0,004) гетерогенности выборки значений 13С. В соответствии с результатом LSD–теста, минимальное и максимальное значения 13С (для мозга и кожи, соответственно) достоверно различаются между собой и большинства иных тканей. Форма распределений средних значений 13С по типам тканей у самок и самцов (см. рис. 1) одинакова (ANOVA, F = 2,586 < 3,500 = Fст, р = 0,103).

Выборки данных, полученных при исследовании тканей самок и самцов, достоверно отличаются одна от другой (критерий КолмогороваСмирнова, р < 0,001; критерий Манна-Уитни, р = 0,0037; ANOVA, группировка значений в соответствии с полом рыб, F=9.415>4,073=Fст, р = 0,004).

Иными словами, ткани самцов обогащены тяжелым изотопом углерода в сравнении с тканями самок.

головной мозг -А Рис. 1. Распределение значений -13С (А, Б) и 15N (В) органов самок кожа гонада -(сплошная линия) и самцов (пунк-тир) взрослых вьюнов. А – первая -серия измерений; Б, В – вторая серия измерений. По осям отложены хрусталик мышечная ткань значения изотопного отношения в ‰.

гепатопанкреас Г В головной мозг Б В головной мозг --кожа -гонада кожа гонада --хрусталик мышечная ткань хрусталик мышечная ткань гепатопанкреас гепатопанкреас Распределения значений 13С, полученные во второй серии измерений (рис. 1, Б), не отличаются от таковых, полученных в первой серии, для тканей как самок, так и самцов (критерий Колмогорова-Смирнова, р>0,100; критерий Манна-Уитни, р>0,05). Выборки гетерогенны (ANOVA, группировка данных по типу ткани, F=15,801>4,387=Fст, р=0,002); в соответствии с результатом LSD–теста, эта гетерогенность обеспечена различиями минимальных и максимальных значения 13С (ткани головного мозга и кожи) между собой и от других тканей.

В то же время, выборки значений 13С тканей самок и самцов не различаются (критерий Колмогорова-Смирнова, р>0,100; критерий Манна-Уитни, р=0,423; ANOVA, группировка данных по принадлежности к полу рыб, F=0,192<4,965=Fст, р=0,670).

Таким образом, следует полагать безусловным отличие некоторых тканей по величине 13С как у самок, так и самцов, в то время как различия изотопного отношения углерода в тканях рыб разного пола – лишь как тенденцию.

Выборки значений 15N для тканей самок и самцов статистически не различаются (критерий Колмогорова-Смирнова, р>0,10; критерий МаннаУитни, p = 0,200; ANOVA, при группировка данных в соответствии с полом рыб, F = 1,315 < 4,965 = Fст, p = 0,278 ). Дисперсионный анализ вариаций значений 15N в образцах тканей самцов и самок (группировка по типу ткани) также указывает на идентичность значений 15N разных тканей рыб обоего пола (F = 1,686 < 4,387 = Fст, p = 0,271; см. рис. 1, В).

Измерения изотопного отношения углерода зародышей вьюна на протяжении эмбрионального периода (рис. 2) описывается линией, параллельной оси абсцисс (13С = -31,22±0,134). 13С зародышей не изменяется на протя- -Рис. 2. Изменение изотопного от0 2000 4000 6000 8000 -ношения углерода по мере эмбрио-нального развития вьюна. Различ-ные обозначения на графике соот-ветствуют сериям измерений. Ли-30 нией показан тренд, аппроксими-31 рующий разброс точек (см. текст).

Ось абсцисс – время с момент осе-менения икры, мин; ось ординат – -значения 13С в ‰.

-жении развития. На протяжении всего период развития в оболочках умножение численности клеток и морфогенетические события обеспечиваются метаболизируемым материалом желточной клети и желточного мешка. Вероятно, уровень обмена с внешней средой углеродсодержащими молекулами на протяжении эмбриогенез столь невелик, что маскируется вариациями изотопии зародышей, полученных от разных производителей.

Изотопное отношение тканей амфибий Результаты измерений изотопного отношения углерода и азота в тканях 16-, 28- и 36-месячных лягушек представлены на рис. 3 и 4. Выборки значений 13С для самцов и самок лягушек каждой из возрастных групп (рис. 3, А, Б) не различаются. Статистические сравнения демонстрируют явную тенденцию к возрастанию значений 13С в тканях как самцов (критерий Колмогорова-Смирнова, p < 0,100; критерий Манна-Уитни, р = 0,036) так и самок (критерий Колмогорова-Смирнова, p < 0,100; критерий Манна-Уитни, р = 0,072) 28- и 36- месячных лягушек в сравнении с тканями 16-месячных Box & Whisker Plot Box & Whisker Plot -22 -А Б ----------- Median Median 25%-75% 25%-75% -28 -Min-Max Min-Max 16-м 28-м 36-м 16-м 28-м 36-м Box & Whisker Plot Box & Whisker Plot 4,4 5,4,4,В Г 4,4,3,3,3,3,3,3,2,3,2,2,2,1,2,1,2,0,2, Median Median 25%-75% 25%-75% 1,8 0,Min-Max Min-Max 16-м 28-м 36-м 16-м 28-м 36-м Рис. 3. Медиана, квартили и диапазон варьирования значений 13С (А, Б) и 15N (В, Г) в тканях самок (А, В) и самцов (Б, Г) 16-, 28- и 36-месячных лягушек.

лягушек.

Выражено асимметричное распределение значений 13С в соответствии с типом ткани, предопределенное, главным образом, статистически существенными различиями образцов костной ткани, кожи, хрусталика, мышечной ткани между собой и от других тканей, между тем, сохраняет подобие у разголовной мозг -22,00 Б А головной мозг 5,ных возрастных групп (рис. 4, А, В, Д).

хрусталик -24,сердце 4,хрусталик сердце -26,00 3,2,-28,1,кожа -30,00 печень кожа 0,00 печень кость мышечная ткань кость мышечная ткань гонада гонада Г В головной мозг головной мозг 5,-22,4,хрусталик сердце -24,хрусталик сердце 3,-26,2,-28, 1,кожа -30,00 печень кожа 0,00 печень кость мышечная ткань кость мышечная ткань гонада гонада Е Д головной мозг головной мозг -22,00 5,4,хрусталик сердце хрусталик -24,сердце 3,-26,2,-28,00 1,кожа печень 0,кожа -30,00 печень кость мышечная ткань кость мышечная ткань гонада гонада Рис. 4. Диаграммы, иллюстрирующие распределения изотопного отношения углерода (А, В, Д) и азота (Б, Г, Е) в образцах тканей у самок (сплошная линия) и самцов (пунктир) 16- (А, Б), 28- (В, Г) и 36-месячных лягушек. По осям отложены значения изотопного отношения в ‰.

Выборки значений 15N для тканей самок и самцов каждой из возрастных групп с высокой степенью достоверности различаются между собой (рис. 3, В, Г). При этом, у 16-месячных лягушек все без исключения ткани самцов (в сравнении с тканями самок) обеднены тяжелым изотопом азота, в то время как у 28- и 36-месячных лягушек – напротив, обогащены тяжелым изотопом азота. Распределения 15N в соответствии с типом ткани подобны (ANOVA, значимость различий, р>0,05) (рис. 4, Б, Г, Е), как в разных возрастных группах, так и для самок и самцов. Это подобие предопределено сходством значений 15N для всех исследованных тканей в пределах каждой возрастной группы и половой принадлежности лягушек.

Как показали многолетние наблюдения, сроки икрометания остромордых лягушек в популяции, из которой были изъяты подопытные особи, сравнительно постоянны и приходятся на последнюю треть апреля. Если полагать (вслед за П.В. Терентьевым, 1950), что половозрелость, достигается у остромордых лягушек на третьем году жизни, то 16-месячных лягушек следует считать ювенильными формами, 28-месячных – поздними ювенильными формами, превращающимися в половозрелые особи, а весенних 36-месячных - половозрелыми формами. В соответствии с этим, значимые изменения величин, отражающие увеличение доли «тяжелых» изотопов углерода и азота в тканях самцов, следует полагать сопряженными с переходом от ювенильной к половозрелой форме. У самок такой переход выражен существенно меньше, поскольку можно констатировать лишь слабую тенденцию изменения значений 13С и 15N.

Лягушки (и R. arvalis в том числе) являются хищниками, лишенными пищевой специализации. Рацион лягушек включает фактически все без исключения группы насекомых (на разных фазах их жизненного цикла), моллюсков, червей. Лягушки поедают все то, что населяет их местообитание и что может быть ими проглочено. Соответственно, крупные особи поедают более крупную добычу, чем мелкие (Терентьев, 1950). Для лягушек второго года жизни (16-месячных) характерно выраженное различие в размерах осо бей разного пола: самцы на треть короче и почти вдвое легче самок того же возраста. Соответственно, рацион мелких самцов 16-месячных лягушек должен включать более мелкую «добычу», чем рацион крупных самок этого же возраста, что, возможно, и проявляется в различии изотопных отношений их тканей. Однако, выравнивание размеров самцов и самок на третьем году жизни (что позволяет предполагать унификацию их рациона) отнюдь не приводит к выравниванию значений изотопного отношения: ткани самцов оказываются существенно более богатыми тяжелым изотопом азота в сравнении с тканями самок. Это явление, вероятно, свидетельствует о существовании периода кардинальных изменений метаболизма самцов в сравнении с таковым у самок. Описанная динамика изменений изотопного отношения азота у самцов остромордых лягушек является не только демонстраций различий изотопных отношений у особей разного пола, но и отражает онтогенетический тренд этого показателя.

Изотопное отношение углерода тканей мышей Значения 13С тканей у 1- и 22-месячных самок мышей представлены в таблице 1. Изотопное соотношение в образцах пищи (13С = -25,2±0,61; результат шести определений), на которой содержали животных, значимо (p < 0,05) отличается от характерных изотопных отношений тканей и органов мышей из обеих возрастных групп.

Распределения средних значений 13С у 1- и 22-месячных мышей значимо различаются (критерий Колмогорова-Смирнова, p < 0,005: критерий Манна-Уитни, р = 0,002). Средние значения 13С соответствующих тканей 1- и 22-месячных мышей также различаются.

Распределения значений 13С в соответствии с типом ткани асимметричны как для 1-, так и для 22-месячных мышей ( ANOVA, p < 0,00001; см.

рис. 5, А). Асимметрия предопределена значениями 13С костной ткани, сухожилия хвоста и хрусталика, различающихся между собой и от остальных тканей.

Таким образом, с достаточной уверенностью можно утверждать, что изотопное отношение углерода во всех тканях 22-месячных животных смещено (причем в различной степени) в сторону легкого изотопа углерода.

Таблица 1.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»