WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Бедник Дарья Юрьевна ИЗМЕНЧИВОСТЬ ИЗОТОПНОГО ОТНОШЕНИЯ УГЛЕРОДА И АЗОТА В ОНТОГЕНЕЗЕ И ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЯХ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ВЫСШИХ И НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ 03.00.30-03 – биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2009 1

Работа выполнена на кафедре эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук Доронин Юрий Константинович Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Бурлаков Александр Борисович Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва доктор биологических наук Антохин Александр иванович ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава, Москва

Ведущая организация: Федеральный медицинский биофизический центр им.А.И. Бурназяна при ФМБА России

Защита состоится 17 марта 2009 года в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан « » 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, Е.Н. Калистратова кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В 1939 г. А. Нир и Э. Гульбрансен (Nier, Gulbransen, 1939) разделили в соответствии с изотопным составом углерода компоненты земной поверхности на четыре группы. В одну из этих групп, включены главным образом растительные формы, отличающиеся от магматических и метаморфических пород и карбонатов выраженной асимметрией в соотно12 13 шении стабильных изотопов углерода С и С в сторону первого. Именно это явление – обогащенность растительных и животных форм легким изотопом углерода – получило название биологического фракционирования изотопов.

С того времени достигнуты существенные успехи в понимании механизмов изотопии – в целом, и биологической изотопии, в частности (Галимов, 1981, 2006; Бучаченко, 2007); накоплен значительный фактический материал об изотопии, как различных живых форм, так и основных их биохимических компонентов; убедительно показана связь изотопии растительных форм со способами фиксации СО2 и азота и зависимость изотопного состава гетеротрофов от типов питания (Park, Epstein, 1960, 1961; Ehleringer et al.; Peterson, Fry, 1987; Griffiths, 1991; Gannes et al, 1997). Изотопные отношения стабильных форм углерода и азота и их изменения стали широко использоваться «в качестве «индикатора» движения вещества и энергии, и в качестве «интегратора», для оценки направления и интенсивности экологических процессов…» (Тиунов, 2007, с.475); в частности, определение изотопного отношения стало наиболее популярным методом выявления путей миграции и трофических связей животных организмов.

С накоплением сведений об изотопии автотрофов и гетеротрофов несколько «размылось» четкое и ясное представление о физико-химических механизмах изотопного фракционирования. Стало очевидным, что столь динамическая система как организм, обладающая мощными системами гомеостаза, привносит свои, специфические коррективы в процессы фракционирования. Существенный успех для объяснения фракционирования и, главное, многообещающие перспективы направленных влияний на организменные события, привнесло открытие специфических ядерно-спиновых изотопных эффектов (Бучаченко и др., 1976).

Ядерно-спиновый изотопный эффект обеспечен появлением магнитного момента у молекул, включающих в свой состав стабильные изотопы с нецелочисленным ядерным спином. Молекулы такого рода обречены взаимодействовать с парамагнитными структурами, в число которых входят радикалы. Свободнорадикальные формы достаточно обычны для живой материи.

Особую роль имеют свободнорадикальные формы кислорода, порождающие многообразные радикальные формы, что губительно сказывается на структуре и функциях макромолекул в живой системе. Предполагается, что в силу изотопного эффекта (т.е. в силу специфики химических взаимодействий структур, несущих в своем составе стабильные изотопы) молекула, несущая в своем составе стабильный изотоп оказывается «защищенной» от губительного влияния реактивных радикальных форм (Shchepinov, 2007).

Существует еще один аспект проблемы биологического фракционирования изотопов. В результате промышленной деятельности в атмосферу выбрасывается огромное количество углекислого газа, на 2-8‰ обогащенного изотопом 12С (Friedman, Irsa, 1967; Галимов, 1987). Влияния такого рода обогащения атмосферы, особенно в мегаполисах и промышленных районах, на состояние и репродуктивные способности растений, потребляющих их гетеротрофов, в том числе и на человека - остается неизвестными.

Смещение изотопного отношения в тканях растений в сторону легкого изотопа отмечено с 40-х прошлого столетия. Начиная с конца 80-х годов, эта тенденция кардинально поменялась: вплоть до настоящего времени годовые кольца деревьев неуклонно и достаточно быстро обогащаются тяжелым изотопом углерода (Воронин и др., 2003). А.А. Ивлев (2005) связывает смену изотопного облегчения с непрерывным возрастанием концентрации и изотопным утяжелением CO2 в атмосфере, с возрастанием среднегодовой температуры и, как следствие, с усилением фотодыхания. События такого рода представляется угрожающими, поскольку развиваются по принципу положительной обратной связи: «планетарные лёгкие» изменяют свой функциональный статус, превращаясь в потребителя кислорода и поставщика углекислого газа, что, в свою очередь, усугубляет планетарный парниковый эффект.

Механизмы сегрегации изотопов на организменном уровне (особенно у гетеротрофов) остаются до конца не известными, хотя по этому поводу нет недостатка в предположениях и гипотезах. Более того, сведения об изотопии органов и тканей гетеротрофных организмов, о динамике изотопных отношений на разных этапах жизненного цикла, о роли изотопного отношения для нормального функционирования организмов, - представлены фрагментарно и очевидно недостаточно.

В этой связи, целью исследования стало определение изотопного отношения в тканях на различных этапах онтогенеза и при разных состояниях у самок и самцов трех видов систематически существенно различающихся организмов: рыб, амфибий и млекопитающих. Для достижения этой цели разрешались следующие экспериментальные задачи: 1) получение материала, подготовка препаратов для масс-спектрометрии и собственно массспектрометрическое определение изотопного отношения углерода и азота и 2) анализ и сопоставление полученных данных.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате исследования получен ряд новых, ранее неизвестных фактов, свидетельствующих о различиях изотопного отношения углерода и азота в разные периоды онтогенеза. Так, показано, что ткани ювенильных самцов остромордых лягушек существенно обеднены тяжелым изотопом азота, что, вероятно, связано с различиями размеров и рационов совозрастных особей разного пола. С наступлением половозрелости, выравниванием размеров и унификацией рациона происходит не только выравнивание изотопного отношения азота у особей разного пола, но и обогащение тканей самцов тяжелым изотопом.

Ткани одномесячных мышей существенно богаче тяжелым изотопом углерода в сравнении с соответствующими тканями 22-месячных мышей, что пре допределяется обеднением тяжелым изотопом белковой фракции этих тканей. Тенденция обеднения тяжелым изотопом углерода отмечена также для фракций липидов и нуклеиновых кислот. На большем протяжении плодного периода изотопное отношение углерода тканей эмбрионов мыши идентично изотопному отношению соответствующих тканей материнских организмов, но непосредственно перед рождением смещается в сторону тяжелого изотопа. На основании полученных данных можно также предполагать своего рода половой диморфизм изотопного отношения. Помимо обогащения тяжелым изотопом азота тканей самцов лягушек в период полового созревания (в сравнении с тканями совозрастных самок) (см. выше), отмечена выраженная тенденция к обогащению тяжелым изотопом углерода тканей самцов рыб и плодов мужского пола мышей непосредственно перед их рождением. В то же время, существенные изменения состояния организма, вопреки ожиданиям, могут не сопровождаться какими-либо изменениями изотопного отношения тканей. Так, сезонная гибернация не сказывается на изотопном отношении углерода и азота: значения 13С и 15N соответствующих тканей у активно питающихся лягушек в период перед зимней спячкой сразу после выхода из спячки сохраняются неизменными. Ткани каждого из исследованных видов классифицированы в группы в соответствии с изотопным отношением и определены видовые пределы вариации этого показателя. Последнее может оказаться существенным для оценок трофических отношений видов в экологических исследованиях. Результаты работы используются в курсах лекций по биологии развития.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научном семинаре кафедры эмбриологии биологического ф-та МГУ имени М.В. Ломоносова, Симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007г.), XVIII Симпозиума по геохимии изотопов имени академика А.П. Виноградова (Москва, 2007г.), XVI Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в ме дицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2008г.), Всероссийская конференция «Фундаментальная наука и клиническая медицина» Одиннадцатая медико-биологическая конференция «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2008г.) Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них статей – 1, тезисов конференций – 4.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на страницах и состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Объекты и методы исследования», «Результаты исследования и их обсуждение», «Выводы», «Список цитированной литературы». Работа включает _ таблиц и _ иллюстраций. Список цитированной литературы содержит _ наименований, из которых _ на русском, _ на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Вьюны Misgurnus fossilis L. были отловлены в декабре-январе 2006–2007г. в Мещерском районе Рязанской области. В лабораторных условиях, на протяжении зимы и весны самцов и самок вьюнов содержали отдельно в 20-ти литровых аквариумах при температуре +5С. Для масс-спектрометрического анализа использовали ткани и органы рыб (гепатопанкреас, головной мозг, фрагмент дорсальной мускулатуры средней части тела, хрусталик, фрагмент кожи с дорсолатеральной поверхности в середине тела, гонады), отловленных в декабре 2006г (первая серия) и 2007г (вторая серия) и содержавшихся в лаборатории до апреля 2007г. и 2008гг.

В первой серии определяли изотопное отношение углерода тканей отдельных рыб: трех самок (со средним весом в 18,9±5,09 г) и четырех самцов (со средним весом 23,1±3,33 г). Во второй серии определяли изотопное отношение углерода и азота и процентное содержание этих элементов. В этой серии образцы тканей формировались объединением равных весовых долей однотипных тканей, выделенных от пяти рыб каждого пола. Использовав шиеся самцы и самки были приблизительно одного веса: самки – 18,0±0,66 г;

самцы – 18,4±0,63 г.

Помимо тканей и органов взрослых рыб исследовали изотопное отношение углерода у зародышей вьюнов. После проведения стандартной процедуры осеменения in vitro развивающуюся икру содержали в чашках Петри в прокипяченной и отстоянной водопроводной воде при комнатной температуре. Периодически отбирали от 25 до 50 нормально развивающихся зародышей, которые немедленно помещали в термостат для высушивания.. Таким образом были подготовлены образцы зародышей на различных стадиях развития, полученные от 5 самок.

Остромордых лягушек Rana arvalis Nilsson отлавливали в одном, достаточно ограниченном ареале (Истринский район Московской области) с известным местом икрометания. Для измерений использовали ткани амфибий (печень, желудочек сердца, головной мозг, гонады, фрагмент четырехглавой мышцы бедра, диафиз бедренной кости, хрусталик, фрагмент кожи со спины) разного пола, разного возраста (16-месячных, длиной 4,2±0,17 см (самки) и 3,3±0,09 см (самцы); 28-месячных, длиной 6,0±0,23 см (самки) и 5,9±0,14 см (самцы); 36-месячных, длиной ~ 5,5 см). 36-месячные лягушки были выловлены в месте икрометания, т.е. в момент, когда они только вышли из зимовки, и еще не питались. В отличии от этой группы, 16- и 28-месячные лягушки были выловлены в августе и активно питались.

Образцы для масс-спектрометрического измерения формировались объединением равных весовых долей тканей одного типа, выделенных от особей каждого пола. В образцах, полученных от лягушек тканей, определяли изотопное отношение углерода, азота и процентное содержание этих элементов.

Лабораторных мышей (линия С57BL/6) с момента полного перехода на самостоятельное питание содержали в виварии в стандартных условиях.

На протяжении всего срока существования животных кормили ab libitum кормом для разведения крыс, мышей и хомяков (рецепт ПК-120, ГОСТ Р50.258-92; ООО «Лабораторкорм», Москва).

Ткани и органы (печень, почки, желудочек сердца, головной мозг, яичник, фрагмент четырехглавой мышцы бедра, выделенное из соединительнотканной капсулы пятое ребро, хрусталик, сухожилие хвоста) для массспектрометрического определения изотопного отношения углерода были получены от десяти взрослых самок мышей (пяти одномесячных и пяти 22месячных). Для масс-спектрометрического измерения приготавливали образцы тканей каждого животного. Часть тканей и органов 1- и 22-месячных мышей (печеночная ткань, почка, головной мозг, мышечная ткань, желудочек сердца) замораживали и хранили при температуре -40°С для последующего выделения основные биохимических фракций.

Изотопные отношения также определяли в тканях эмбрионов мышей.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»