WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

В ходе дальнейших исследований было обнаружено, что эффект снижения краевого угла смачивания в присутствии ДФФХ становился менее выраженным при повышении кислотности раствора. Так, угол смачивания силанизированных стекол водой в присутствии ДФФХ рос примерно от 60 до 80 градусов при уменьшении рН раствора от 7 до 3. Аналогичный эффект наблюдался и на поверхности тефлона. В контрольных экспериментах было показано, что в отсутствии липида краевой угол не зависит от pH.

Формирование БЛМ, не содержащих растворитель. Весьма существенно, что при низких значениях рН краевой угол приближается к 90 градусам, что обеспечивает необходимые граничные условия для формирования БЛМ, не содержащих растворитель (White et al., 1976). По описанной выше методике нам удалось сформировать такие мембраны при низких значениях рН. Их время жизни в среднем составляло несколько часов, а электрическая емкость не зависела от частоты подаваемого переменного напряжения в диапазоне от 10 до 1000 Гц.

Оптические наблюдения за процессом формирования мембран показали, что при значениях от 3 до 3,5 мембрана полностью закрывает отверстие в перегородке (см Рис. 1б и 1г), т.е. ее площадь можно считать равной площади отверстия. Исходя из этого предположения, мы оценили удельную электрическую емкость наших мембран и получили значение 0,86 мкФ/см2±5%. Эта величина выше, чем для БЛМ, полученных по классическому методу Монтала (0,8 мкФ/см2) (Chanturiya, 1996). В ходе экспериментов была зафиксирована значительная зависимость электрической емкости полученных мембран от pH среды, в которой они формировались (см. Рис.

1а). Из оптических наблюдений видно, что при увеличении рН второй монослой начинает закрывать лишь часть отверстия в перегородке (см. Рис. 1б и 1г). После образования мембраны изменение рН уже не влияло на ее емкость и способствовало разрушению. Кроме того, как при полном закрытии отверстия вторым монослоем, так и при частичном, невозможно было поднять уровень выше того, на который произошло спонтанное поднятие.

Для проверки бислойности полученных мембран была исследована их проводимость в присутствии каналоформеров, которые могут создавать каналы только в бислойных мембранах (Kleinberg and Finkelstein, 1984). В результате одностороннего добавления нистатина в окружающий мембрану раствор мы наблюдали пропорциональный его концентрации рост проводимости БЛМ (см. Рис.

2).

липидный монослой г б стекло вода бислой стекло в д стекло вода бислой 3 4 5 6 7 8 pH стекло а Рисунок 1. а) Электрическая емкость мембран, не содержащих растворитель, как функция рН водных растворов, в которых они формировались. Диаметр отверстия составлял 277 мкм. б) и в) Фотографии мембран, сформированных при различных рН. Диаметр отверстия – 180 мкм. Один уровень раствора (верхняя граница темной и светлой областей) всегда находится выше отверстия. Второй – подводится под нижний край отверстия. Образование БЛМ происходит спонтанно. Конечное положение второго уровня видно по границе нижней темной области. б) рН = 3,5; БЛМ сформировалась практически на всей площади отверстия. в) рН = 6; бислойная часть занимает лишь небольшую долю отверстия вблизи нижней кромки. г) и д) схематическое изображение БЛМ, сформированных при низких (г) и высоких (д) значениях рН водного раствора.

0 50 100 150 Концентрация нистатина, мкМ Рисунок 2. Зависимость проводимости БЛМ от концентрации нистатина в растворе в одной из полуячеек. Диаметр отверстия 300 мкм, рН 4,5. Прямая на графике соответствует линейной регрессии полученных результатов.

C, пФ G, нСм Эти эксперименты однозначно свидетельствуют о бислойной природе полученных мембран. Значит, изменение электрической емкости на Рис.1а действительно может быть вызвано только изменением площади БЛМ.

Зависимость межфазного натяжения монослоя ДФФХ от рН среды. Для объяснения зависимости площади БЛМ, сформированных по нашей методике, от рН среды, мы изучили рН-зависимость натяжения липидного монослоя на водной субфазе. Было исследовано изменения высоты капиллярного поднятия кромки воды в присутствии липида вдоль гидрофобизированных покровных стекол. В результате измерений были получены следующие зависимости (см. Рис. 3).

а б 2468 pH pH Рисунок 3. а) Зависимость краевого угла смачивания () воды в присутствии ДФФХ от рН для вертикальных гидрофобизированных стеклянных пластинок. б) Зависимость высоты капиллярного поднятия кромки воды в присутствии липида вдоль гидрофобизированных покровных стекол. Каждая точка отвечает отдельному эксперименту, проведенному на свежеприготовленном гидрофобизированном покровном стекле.

Для расчета натяжения монослоя была определена форма поверхности жидкости вблизи перегородки (см. Рис. 4).

a a 2 zx = - Arch + a 2 - + x0 (1) z aгде х0 определяется из условия, что при х=0 z`=-ctg, т.е. z=h=a 1- sin, где h – искомая высота поднятия жидкости у самой стенки.

h, мкм, градус z x Рисунок 4. Форма поверхности жидкости вблизи вертикальной смачиваемой стенки. – краевой угол.

На основе полученных результатов и формулы для высоты капиллярного поднятия кромки жидкости вдоль перегородки мы получили зависимость натяжения монослоя ДФФХ от рН водной субфазы (см. Рис. 5, точки).

0,0,0,0,0,0,2468 pH Рисунок 5. Зависимость межфазного натяжения монослоя ДФФХ от рН водной субфазы. Точки – экспериментальные данные, линия – расчет по уравнению (9), который изложен ниже.

Для описания полученной зависимости мы решили рассчитать изменение натяжения монослоя ДФФХ, происходящее вследствие кислотно-основной диссоциации его полярных групп. Этот липид является цвиттерионом, электронейтральным в широком диапазоне рН, т.к. рКа фосфатной и холиновой группы составляют 2,1 и 10,5 соответственно (Матинян и Абидор, 1984). Для молекулы ДФФХ, имеющей одну кислотную (La) и одну основную группу (Lb), уравнения диссоциации будут следующими:

+ La H L- + H (2) a LbOH L+ + OH (3) b + HOH H + OH (4), Н/м Соответственно, константы равновесия будут иметь вид:

aL H aL OH a b K1 =, K2 =, Kw = aH aOH, где aH, aOH, aL H, aL OH, aL, aL – + - + - - + a b a b aL aH aL aOH - + + a b активности соответствующих компонентов, Kw – ионное произведение воды.

Изменение межфазного натяжения при адсорбции ионов на границе раздела описывается формулой Гиббса:

- d = dµi (5) i где - межфазное натяжение, Гi – поверхностный избыток адсорбирующегося иона, µi - электрохимический потенциал иона. В нашем случае на границе раздела липидный монослой-водный раствор происходит химическое связывание только двух типов ионов – Н+ и ОН, поэтому мы можем переписать уравнение (5) в виде:

- d = H dµH + OH dµOH (6) + + - Считая, что электрический потенциал в объемной фазе не изменяется в процессе адсорбции ионов Н+ и ОН, а также предполагая, что пришедшие к поверхности ионы всегда участвуют в кислотно-основном равновесии с соответствующей группой молекулы липида согласно уравнениям (2-4), мы можем записать:

- d = L H d ln aH - L OHd ln aH (7) + + a b где L H = K1L aH, L OH = K2L aOH, а L H + L = S и L OH + L = S, где S – это - + + - - + a b a b a b a b поверхностная концентрация липида. Таким образом, интегрируя уравнение (7) мы получим:

Ka1 aH + = -SRT ln + 1 + 1 + const (8) aH Ka+ где R – универсальная газовая постоянная, Т – абсолютная температура. Константу интегрирования выберем из условия, что в изоэлектрической точке, когда aH = Ka1Ka2, натяжение должно быть максимальным. В результате мы получим + следующее выражение для натяжения липидного монослоя:

Ka1 Ka1 aH + = + 2SRT ln + 1 - SRT ln + 1 + 1 (9) max aH KaKa+ Из данного уравнения следует теоретическая зависимость натяжения монослоя ДФФХ от рН водного раствора (см. Рис. 5, линия). Из нее следует, что адсорбция Н+ и ОН ионов, участвующих в кислотно-основной диссоциации полярных групп липида, хорошо описывает изменение натяжения монослоя вблизи рК, однако, не может описать уменьшение натяжения, происходящее при рН от 4 до 7.

Известно, что у молекул ДФФХ холиновая группа, заряжаемая положительно, находится на самом краю полярной головки, а фосфатная группа, способная приобретать отрицательный заряд, находится ближе к углеводородному «хвосту».

Однако при образовании контактирующей с водой мембраны из молекул этого липида (как и других фосфатидилхолинов) картина кардинально меняется: в бислое минус (фосфатная группа) оказывается расположенным снаружи, а плюс (холиногруппа) смещается в сторону углеводородных «хвостов», углубляясь внутрь мембраны за счет изменения конформации полярной головки (Dill and Stigter, 1988). На свойства слоя молекул липида также может оказывать влияние специфическая адсорбция ионов, находящихся в растворе. Недавно появилось большое количество работ, указывающих на значительную адсорбцию гидроксилионов на гидрофобных поверхностях (Beattie et al., 2005; Creux et al., 2007; Franks et al., 2005). Поэтому мы предположили, что, возможно, именно специфическая адсорбция ОН ионов на поверхности мембраны может внести изменения в натяжение монослоя и бислоя.

В щелочной среде поверхность липидного бислоя заряжается отрицательно, благодаря диссоциации фосфатной группы, соответственно на рис. 6 в интервале рН от 9 до 10 наблюдается падение натяжения. При дальнейшем переходе в сторону нейтральной среды отрицательный заряд поверхности уменьшается, и натяжение растет согласно формуле (9), постепенно выходя на постоянное значение. Но снижение отрицательного заряда может способствовать усилению адсорбции ОН-ионов вблизи холиновых групп ДФФХ благодаря сильному сродству этих ионов к гидрофобной фазе. Такая неэлектростатическая, т.е.

специфическая адсорбция, по-видимому, ведет к заряжению поверхности мембраны и, как следствие, к наблюдаемому при уменьшении рН от 7,5 до 5,снижению натяжения (см. Рис. 5).

При дальнейшем уменьшении рН от 5,5 до 3,5 начинается постепенный рост положительного заряда поверхности мембраны, обусловленный заряжением холино-групп, с одновременным падением концентрации ионов ОН в растворе, Оба этих фактора снижают специфическую адсорбцию гидроксил-ионов, что приводит к возврату (росту) значений натяжения на расчетную кривую. Далее, при уменьшении рН ход кривой натяжения определяется ростом положительного заряда холино-группы и уже полностью соответствует уравнению (9).

С вышеописанной картиной согласуются и результаты измерения разности граничных потенциалов на мембранах, полученных по методу Мюллера-Рудина, при закислении раствора по одну сторону от них (см. Рис. 6). Рост граничного потенциала в области рН от 2 до 2,5 и от 10 до 11 соответствует сильному заряжению поверхности мембраны, отвечающему ионизации холиновой и фосфатной групп ДФФХ. По аналогии со стандартными кривыми титрования, средняя часть участков резкого увеличения потенциала отвечает 50% ионизации соответствующих групп, т.е. значению рК этих групп. Соответствующие значения рК составляют 2,1 и 10,5, что полностью отвечает литературным данным (Матинян и Абидор, 1984). Необходимо отметить, что изменение потенциала при ионизации холиновой группы в пять раз меньше, чем при ионизации фосфатной. Этот эффект может объясняться сильной экранировкой холиновой группы в молекуле ДФФХ.

Что же касается области рН от 3,5 до 7,5, где наблюдалось значительное снижение натяжения липидного монослоя, то разность граничных потенциалов на мембране ведет себя в этой области следующим образом (см. Рис. 7).

2 4 6 8 10 -20 pH ----Рисунок 6. Зависимость разности граничных потенциалов на мембране, от рН раствора электролита. Концентрация электролита (KCl) составляла 100 мМ.

а б 3 4 5 6 3 4 5 6 pH pH Рисунок 7. Зависимость разности граничных потенциалов на мембране, сформированной из раствора ДФФХ в декане, от рН раствора электролита.

Концентрация электролита составляла: а) 100 мМ KCl; б) 10 мМ KCl.

При падении концентрации ионов ОН в растворе их специфическая адсорбция и обусловленный ею отрицательный заряд поверхности уменьшаются, в результате чего на кривой изменения граничного потенциала возникает дополнительный перегиб, аналогичный по форме тем, которые отражают ионизацию фосфатной и холиновой групп ДФФХ, но только меньший по амплитуде. Фактически, адсорбированные на мембране вблизи гидрофобных «хвостов» ионы ОН ведут себя как некая новая ионизующаяся группа. Кроме того, как было показано в работе (Zhou and Raphael, 2007), для фосфатидилхолиновых мембран дипольный скачок потенциала изменяется на 6,5 мВ пропорционально рОН. Таким образом, можно Г, мВ Г Г, мВ, мВ предположить, что именно специфическая адсорбция гидроксил-ионов приводит к падению натяжения монослоя ДФФХ в диапазоне рН от 4 до 7.

Из экспериментальных данных о зависимости электрической емкости БЛМ, не содержащих растворитель, от рН водного раствора мы можем рассчитать высоту спонтанного поднятия одного монослоя липида по другому, происходившего в процессе формирования липидного бислоя (см. Рис. 8). Предположим, что верхняя граница частично «запрыгнувшего» монослоя является прямой. Тогда площадь соответствующего сегмента отверстия, занятого этим монослоем, можно записать в виде:

S h h 2h h = - 2 arccos - (1- ) 1- (10) R2 2R R R 2R где h- высота поднятия, R – радиус отверстия в перегородке. Значения площади мы можем рассчитать, зная величину удельной емкости БЛМ.

2468 pH Рисунок 8. Рассчитанная из величин электрической емкости БЛМ рНзависимость высоты спонтанного поднятия одного монослоя липида по другому, происходящего в процессе формирования мембраны.

Таким образом, обнаруженная нами зависимость высоты спонтанного поднятия одного монослоя липида по другому является, по всей видимости, следствием изменения краевого угла смачивания перегородки водным раствором с монослоем липида от рН среды, а также начальной высотой поднятия кромки жидкости у гидрофобной перегородки.

h, мкм Исходя из полученных данных, мы можем рассчитать значения краевого угла смачивания на границе между липидными хвостами и натяжение липидного бислоя как функции от рН среды.

Формирование БЛМ методом сведения монослоев определяется балансом трех сил. Две из них равны по модулю натяжению липидного монослоя на поверхности воды, а третья соответствует натяжению бислоя. Рассчитанная зависимость последнего от рН в этом случае будет иметь вид (см. Рис. 9б).

а б pH pH Рисунок 9. Рассчитанные по экспериментальным данным: а) рН-зависимость краевого угла смачивания () одного монослоя ДФФХ другим; б) Зависимость натяжения липидного бислоя от рН среды.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»