WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |
Учреждение Российской академии наук Институт физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН на правах рукописи БАТИЩЕВ ОЛЕГ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ БИОЭЛЕКТРОХИМИЯ БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН, НЕ СОДЕРЖАЩИХ РАСТВОРИТЕЛЬ Специальность 02.00.05 – Электрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2008 Работа выполнена в Учреждение Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН Научный руководитель:

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Андрей Владимирович Инденбом Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук Александр Михайлович Емельяненко Доктор химических наук Александра Мордухаевич Скундин Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биооpганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Защита состоится 21 октября 2008 года в 11 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.259.03 при Учреждение Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский проспект, д. 31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН.

Автореферат разослан 18 сентября 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук Г. М. Корначева 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Введение. Актуальность проблемы. Плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) являются давно известной удобной системой для моделирования клеточных мембран. Они позволяют изучать различные электрохимические свойства липидных бислоев, такие как распределение электрического потенциала, адсорбция ионов, строение двойного электрического слоя, влияние внешних электрических полей, ионный транспорт, процессы их слияния, деления и т.п. (Tien, 1974). Все известные на сегодняшний день методы получения БЛМ сводятся к двум основным: первый – нанесение на отверстие в тефлоновой перегородке капельки раствора липида в неполярном органическом растворителе (метод МюллераРудина) (Mueller et al., 1962), второй – сведение двух монослоев на отверстии в перегородке, разделяющей две полуячейки (метод Монтала) (Takagi et al., 1965;

Montal and Mueller, 1972). Оба эти метода имеют один значительный недостаток – это наличие микролинз растворителя в центральной гидрофобной области мембраны и избыток липида в растворителе в окаймляющем мембрану мениске (Montal and Mueller, 1972; White et al., 1976; Chanturiya, 1996). Присутствие растворителя в мениске приводит к неконтролируемому значению натяжения мембран, что затрудняет изучение их механических параметров; слияние мембран может инициироваться при встрече микролинз растворителя, принадлежащих контактирующим бислоям (Berestovsky and Gyulkhandanyan, 1976), что не может реализовываться на биологических мембранах. Все это послужило причиной поиска возможных путей минимизации количества растворителя в БЛМ.

Существует целый ряд работ, в которых описаны различные модификации методик формирования мембран, подразумевающие использование высокомолекулярных растворителей, почти не образующих микролинз, (White, 1978), вымораживание растворителя из мениска (White, 1974) или изменение экспериментальной системы (Vodyanoy and Murphy, 1982). Однако эти модификации вносили ограничения в применимость данной модельной системы. Таким образом, получить БЛМ, не содержащей растворитель ни в мениске, ни в самом бислое, так и не удалось.

Недавно для формирования мембран было предложено использовать гидрофобизированные неорганические материалы (стекло или кремний) вместо полимеров (Pantoja et al., 2001), так как поверхностные свойства полимерных пленок (тефлон, полиэтилен и т.п.) характеризуются большой нестабильностью, в отличие от твердой поверхности неорганических материалов. Это направление показалось нам достаточно перспективным, так как химическая модификация поверхности неорганических материалов различными агентами открывает практически неограниченные возможности изменения ее свойств, не влияя при этом на свойства бислоя. Для формирования мембран в наших экспериментах мы решили использовать дифитаноилфосфатидилхолин, ДФФХ, т.к. из литературных данных известно, что он имеет рКа 2,1 и 10,5, т.е. остается электронейтральным в широком диапазоне рН (Davenport, 1971), а также не претерпевает фазовый переход в диапазоне температур от -120°C до +80°C (Silvius, 1982).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение и исследование свойств бислойных липидных мембран, не содержащих растворитель. Конкретные задачи состояли в следующем:

1) разработать методы химической модификации поверхности материалов для последующего формирования на отверстиях в них БЛМ, не содержащих растворитель;

2) изучить влияние раствора электролита на процесс формирования мембран;

3) разработать методику формирования мембран, не содержащих растворитель, на отверстиях в материалах с модифицированной поверхностью;

4) определить электрические (удельные емкость и проводимость) и механические (латеральное и линейное натяжение) параметры БЛМ, не содержащих растворитель, и сопоставить их со свойствами классических БЛМ.

Научная новизна. В работе удалось решить задачу формирования БЛМ, полностью лишенных растворителя, с помощью разработки методик алкилирования стекол, что является существенным прорывом в вопросе создания искусственных липидных мембран. Были обнаружены и исследованы эффекты изменения поверхностных свойств монослоев используемого липида и их роль в процессе формирования бислоев. Сделан вывод о влиянии специфической адсорбции гидроксил-ионов в области полярных «головок» липидных молекул на натяжение липидных монослоев и бислоев.

Практическое значение работы. Разработанная и исследованная в диссертации методика формирования бислойных липидных мембран может быть использована для изучения широкого круга мембранных явлений, таких, как процессы слияния и деления мембран, вирус-индуцированного слияния, транспорта ионов через каналы, образование доменов в липидном бислое и т.д. Одним из важных результатов работы является демонстрация того, что нейтральный липид ДФФХ значительно меняет свои свойства при изменении рН в области электронейтральности вблизи от изоэлектрической точки. Полученные в работе зависимости натяжения липидных монослоев и бислоев от рН среды важны для описания процессов функционирования клеточных мембран.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на конференциях молодых ученых ИФХЭ РАН (Москва, 2006, 2007); на 8-м международном Фрумкинском симпозиуме «Кинетика электродных процессов» (Москва, 2005); на 19-м международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Тулуза, Франция, 2007); на научных семинарах лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН (Москва, 2004–2008).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в трех статьях в отечественных и международных реферируемых журналах, входящих в список ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 93 страницах, включает 25 иллюстраций. Диссертация состоит из введения, четырех основных частей и заключения. Список цитированной литературы содержит 138 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение гидрофобных стекол.

Подложки для последующего формирования БЛМ изготовлялись из покровных стекол (Thomas Scientific, США) толщиной 100 мкм, в которых путем химического травления в плавиковой кислоте получали круглые отверстия диаметром 150 – мкм. Для очистки и активации поверхности стекла применялся метод обработки плазмой водяных паров. Создание индукционного плазменного заряда осуществлялось посредствам собранной нами установки, состоящей из форвакуумного насоса («MLW», модель DSE 8, Германия), генератора ультравысоких частот (модель УВЧ-30-2, ГЗАС им. А.С. Попова, Россия) и системы напуска водяных паров, контролируемого с помощью вакуумметра (13ВТ3-003, Россия). Обработка покровных стекол производилась в течение минут непосредственно перед дальнейшей химической модификацией.

Гидрофобизация проходила согласно предложенной нами методики их последовательной обработки несколькими хлорсиланами в порядке убывания длины углеводородного «хвоста»: октадецилтрихлорсиланом, диметилдецилхлорсиланом и диметилдихлорсиланом («Fluka Chemie», Германия).

Покровные стекла выдерживались в 3% растворе (по объему) соответствующего хлорсилана в толуоле (для УФ – спектроскопии, «Chemapol», Чехия) в течение часа в атмосфере аргона, после чего троекратно промывались толуолом для удаления молекул хлорсилана, не связавшихся с поверхностью, и выдерживались в сушильном шкафу в течение 30 минут при температуре 120 градусов. Затем процедура повторялась для следующего хлорсилана (Батищев и Инденбом, 2004).

Для дальнейшей работы использовались только свежеприготовленные образцы (в течение 1 – 3 суток после изготовления).

Получение амфифобных стекол.

Предварительная обработка покровных стекол перед амфифобизацией (фторосиликонизацией) проводилась так же, как и при гидрофобизации.

Фторосиликонизация осуществлялась путем кипячения стекол в течение 8 часов в 2% растворе (по объему) 3,3,3-Трифторпропилтриметоксисилана («Fluka Chemie», Германия) в толуоле (для УФ – спектроскопии, «Chemapol», Чехия) в колбе с обратным холодильником, после чего они троекратно промывались толуолом для удаления остатков фторсилоксана, не связавшихся с поверхностью, и прогревались в сушильном шкафу в течение 30 минут при температуре 120 градусов. При такой обработке поверхность стекла приобретала амфифобные свойства, т.е. становилась как гидрофобной, так и липофобной (Batishchev and Indenbom, 2008). Для дальнейшей работы также использовались только свежеприготовленные образцы (в течение 1 – 3 суток после изготовления).

Измерение краевых углов смачивания.

О гидрофобности и липофобности полученных образцов и их изменении в присутствии липидов судили по краевым углам смачивания чистой водой и водой с монослоем липида. Для этого на поверхность стекла или тефлоновой пленки наносили каплю воды объемом 5 мкл и 0,25 мкл раствора 1,2-дифитаноил-snглицеро-3-фосфохолина, ДФФХ, («Avanti Polar Lipids», США) в гексане (для хроматографии, «Реахим», Россия) с концентрацией 0,1 г/л. Такое количество липида является минимально необходимым для образования монослоя на поверхности водной капли. Краевой угол измеряли по изображению капли на экране монитора («TVS», модель MM-15, Тайвань), полученному с помощью микроскопа (МБС-2, Россия) посредством цифрового фотоаппарата («Nikon», модель Coolpix 4500, Япония).

Формирование мембран.

Бислойные липидные мембраны, не содержащие растворитель, формировались методом сведения монослоев (Takagi et al., 1965; Montal and Mueller, 1972) в ячейке, состоящей из двух частей (полуячеек), между которыми располагалось гидрофобизированное либо амфифобизированное покровное стекло с отверстием.

Полуячейки заполнялись 0,1 М раствором KCl (чистота 99,8%, «Реахим», Россия) в дважды дистиллированной воде так, чтобы уровень жидкости находился немного ниже отверстия в стеклянной перегородке. Кислотность среды варьировали добавлением HCl. Для образования монослоя липида на поверхность воды в каждую полуячейку наносили 5 мкл раствора ДФФХ в гексане концентрацией 1 г/л.

Монослои сводились путем поочередного поднятия уровней жидкости в полуячейках через 15 мин после нанесения раствора липида. За процессом образования мембран следили по изображению на экране монитора («TVS», модель MM-15, Тайвань), полученному с помощью микроскопа (МБС-9, Россия) посредством цифрового фотоаппарата («Nikon», модель Coolpix 4500, Япония).

Электрические измерения проводились разработанным в нашей лаборатории потенциодинамическим методом (Абидор и др., 1980). Треугольные импульсы напряжения амплитудой 100 мВ (от пика до пика) и частотой 200 Гц подавались с генератора электрических сигналов специальной формы («EG&G Parc», модель 175, США) на мембрану с помощью пары хлорсеребряных электродов. Токовые отклики регистрировались с помощью усилителя тока («Keithley», модель 428, США) и выводились на компьютер с помощью карты АЦП («Л-кард», модель L761, Россия). Величины проводимости и емкости мембран рассчитывались на основе эквивалентной схемы с их параллельным соединением (аналог адмиттанса).

Такая схема отвечает свойствам липидных мембран, имеющих значительно более высокое удельное электрическое сопротивление, чем удельное сопротивление раствора электролита в ячейке. Формирование мембран регистрировали по резкому росту электрической емкости.

Измерение разности граничных потенциалов на мембране.

Измерения проводились по методу компенсации внутримембранного поля, предложенному в (Соколов и др., 1980). БЛМ формировались по методу МюллераРудина (Mueller et al., 1962) из раствора ДФФХ в декане (концентрация 15 г/л) на отверстии диаметром 1 мм в тефлоновой перегородке. Разность граничных потенциалов БЛМ измеряли по величине второй гармоники емкостного тока.

Измерения осуществлялись посредствам фазочувствительного усилителя DSP- (Signal Recovery, США), который управлялся через приборный интерфейс GPIB (Measurement Computing, США). Кислотность среды варьировали добавлением 100 мМ раствора HCl в соответствующем растворе электролита (KCl) с одной стороны от мембраны.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Формирование БЛМ на отверстиях в гидрофобизированных стеклянных перегородках.

Получение гидрофобизированных поверхностей. Причины, по которым присутствие растворителя столь необходимо для формирования плоских БЛМ, кроются в граничных условиях, определяющих этот процесс. И главной из этих причин является то, что для правильной ориентации липидных молекул вблизи кромки отверстия необходимо повышать гидрофобность перегородок (подложек), так как в присутствии амфифильных молекул липида она значительно снижается.

Для достижения максимальной гидрофобности гладких стеклянных перегородок нами была разработана методика последовательной гидрофобизации поверхности несколькими хлорсиланами в порядке убывания длины углеводородного «хвоста», когда более короткие молекулы хлорсиланов могут занимать свободные участки на поверхности, оставшиеся после обработки более длинными. В результате были получены значения краевых углов смачивания водой на данной поверхности около 100° – 110°, что близко к таковым для тефлона (110° - 120°). При наличии липидного монослоя на поверхности капли этот угол уменьшался примерно до градусов, что ставило под сомнение возможность формирования устойчивых БЛМ на отверстиях в таких перегородках.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»