WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

В цитоплазме клетки динамин всегда находится вместе с ГТФ. Поэтому во второй серии экспериментов исследовали взаимодействие белка с нанотрубками в присутствии ГТФ. Одновременная аппликация динамина (0.04 мг/мл) и ГТФ (1 мМ) приводила к такому же скачкообразному делению НТ (см. рис. 8б) – проводимость НТ менее чем за 1 мс падала до 0 (см. рис. 9б). Обрыв НТ наблюдался в 11 из 14 таких экспериментов. Поджатие НТ перед этим если и наблюдалось, то было незначительным: на рисунке 8в черный столбец из правой пары соответствует значению относительной проводимости НТ, которое она достигала перед делением. Когда вместо ГТФ использовали его негидролизуемый аналог ГТФS, динамин не рвал НТ, а сжимал их так же, как делал это без ГТФ (в 4 из 4 экспериментов). В отличие от НТ в присутствии ГТФ и динамина шНТ оставалась стабильной, при этом она слегка поджималась (см. рис. 8б). Поджатие было примерно вдвое слабее, чем в присутствии одного динамина (см. рис 8в). Стоит отметить, что уровень относительной проводимости, который достигала шНТ, не зависел от способа введения ГТФ – после динамина или одновременно с ним (см. рис. 8в). Длину такой шНТ можно было спокойно уменьшать практически до 0, трубка не рвалась. Полученные данные свидетельствует о том, что гидролиз ГТФ препятствует образованию протяженной жесткой белковой структуры и, тем самым, не позволяет динамину сжимать НТ и шНТ по всей длине.

Далее было показано, что деление НТ в этих условиях не сопровождалось формированием проводящих дефектов в ее мембране. Для этого в верхний отсек ячейки, изображенный на рисунке 1, погружали третий электрод, с помощью которого следили за электрической утечкой мембраны. В момент обрыва НТ никаких всплесков ее проводимости не было. Это говорит о том, что деление НТ идет через образование структуры полуделения, что возможно только после того, как НТ будет сжата так, что ее внутренний монослой сможет локально перезамкнуться. Следовательно, динаминовая спираль, конформационные изменения в которой приводят к делению НТ, очень короткая. В противном случае мы наблюдали бы значительное уменьшение проводимости нанотрубки перед ее делением.

Рис.8. Влияние динамина и ГТФ на относительную проводимость нанотрубок. а – добавление ГТФ к сжатым динамином нанотрубкам приводит к росту проводимости как НТ (черная кривая), так и шНТ (серая кривая). НТ всегда рвалась после некоторого периода роста ее проводимости, в то время как шНТ оставалась стабильной и снова быстро сжималась после удаления ГТФ. б – одновременная аппликация динамина и ГТФ вызывала быстрое деление НТ (черная кривая) и слабое поджатие шНТ (серая кривая), длину шНТ можно было свободно варьировать. в – характерные уровни проводимости, которые достигают НТ (черные столбцы) и шНТ (серые толбцы) после инкубации с динамином; после добавления ГТФ к нанотрубкам, сжатым динамином; после инкубации одновременно с динамином и ГТФ (для НТ в последних двух случаях имеется в виду проводимость, предшествующая ее разрыву).

Для регистрации формирования на поверхности НТ таких коротких динаминовых структур был проведен ряд экспериментов с короткими НТ. Для этого, в присутствии динамина (0.04 мг/мл) и ГТФ (1 мМ) нанотрубку сразу после формирования быстро укорачивали до 400 ± 200 нм длины (см. рис. 9а). В 18 из 18 экспериментов делению короткой НТ всегда предшествовали медленные волнообразные флуктуации ее проводимости (см. рис. 9а), тогда как в отсутствии ГТФ колебания проводимости не наблюдались. Из анализа изменения проводимости НТ в этих экспериментах можно выделить два процесса: медленный (десятки секунд), соответствующий обратимому изменению геометрии НТ (сужение/расширение участка НТ), и быстрый (доли миллисекунд), соответствующий непосредственно делению НТ. Мы считаем, что быстрый процесс напрямую не связан с конформационными изменениями динаминовой спирали, так как они никогда не наблюдались в экспериментах с шНТ, а распределение времен жизни НТ в этих условиях было довольно широким (см. рис.

9в). Кроме того, маловероятно, что первое же конформационное изменение всегда приводит к делению НТ. Поэтому медленным процессам, описанным выше, скорее всего, соответствуют конформационные изменения динаминовой спирали на поверхности НТ.

Можно предположить, что жесткость динаминовой спирали определяется только латеральным (т.н. стэкинг) взаимодействием плотно примыкающих друг к другу витков, о котором известно, что оно ответственно не только за самосборку спирали, но и ускорение гидролиза ГТФ. Тогда, согласно нашим данным, кооперативный гидролиз ГТФ должен приводить к разъединению витков, в результате чего спираль теряет жесткость и перестает фиксировать форму НТ. Более того, с помощью электронной микроскопии ранее было показано, что в присутствии ГТФ динамин формирует нерегулярную спираль, имеющую большое количество протяженных участков с неплотной упаковкой динамина (Stowell et. al., 1999). Это объясняет как наблюдаемое расширение сжатых динамином нанотрубок после добавления к ним ГТФ (см. рис. 8а), так и колебания проводимости коротких НТ (см. рис. 9а), которые отражают динамическое равновесие спирали между “жестким” и “мягким” состояниями. Из анализа амплитуды этих колебаний мы нашли, что в присутствии ГТФ (мМ) спираль содержит от 3 до 5 жестких витков.

Рис. 9. Деление короткой НТ динамином в присутствии ГТФ. а – Делению коротких НТ предшествуют волнообразные колебания ее проводимости. б – Одновременное измерение проводимости НТ (черная кривая) и проводимости утечки сквозь стенку НТ (серая кривая). Сноска наверху изображает деление с большим временным разрешением. в – Гистограмма времен жизни коротких НТ в присутствии динамина и ГТФ.

Механизм деления НТ ГТФазой динамином. Нами показано, что, с одной стороны, гидролиз ГТФ необходим для деления НТ, но, с другой, его энергия расходуется не на дальнейшее сужение и деление мембраны НТ, а на разъединение витков динаминовой спирали, в результате чего последняя теряет жесткость. Так как динамин вызывал деление только НТ, а шНТ оставалась стабильной, мы считаем, что именно значение радиуса, который динамин навязывает нанотрубке до гидролиза ГТФ, определяет возможность ее дальнейшего деления. В теоретической работе (Kozlovsy and Kozlov, 2003) было показано, что образование структуры полуделения, а вслед за этим и само деление возможно, если радиус кривизны внутреннего монослоя станет меньше 2 нм (радиус люмена ~ 1.5 нм). Поэтому динаминовая спираль сама по себе (без ГТФ) не способна поделить НТ, т.к. она не обеспечивает такого плотного сжатия – радиус люмена, до которого динамин сжимает НТ, равен 2.5 ± 0.нм. Для того чтобы мембрана НТ начала провисать между соседними витками такой спирали, ее внутренний радиус должен стать меньше критического: rc 2 нм - при этом значении расстояние между витками (в случае плотной упаковки это 13 нм) становится равным внешнему диаметру НТ. Если же внутренний радиус НТ несколько больше rc, то для обеспечения ее локального сужения и деления необходимо увеличение расстояния между любыми соседними витками. Чем больше радиус люмена, тем дальше должны расходиться витки. Следовательно, при близких к rc значениях даже незначительное увеличение расстояния между витками спирали может привести к делению НТ. Наше предположение заключается в том, что именно так и происходит деление мембраны в системе “мембранная НТ – ГТФаза динамин”. А именно, динамин сорбируется и наращивает спираль на поверхности НТ, сжимая ее под собой практически до rc. Латеральное взаимодействие витков спирали запускает кооперативный гидролиз ГТФ, который в свою очередь приводит к их разъединению. Далее, как показали теоретические расчеты (Akimov et. al., 2007), в зависимости от длины участка спирали, потерявшего жесткость, может происходить как провисание, так и расширение НТ (см. рис. 10). Расчеты проводились в предположении, что поток липида под спиралью затруднен, и площадь НТ между витками сохраняется. Стоит отметить, что чем длиннее будут участки спирали, оставшиеся жесткими, тем больше времени потребуется на увеличение расстояния между ними. За это время количество гидролизовавших ГТФ примыкающих витков может стать больше, так что заключенной в них НТ будет уже более выгодно расширяться (см. рис. 10).

Это объясняет наблюдаемый нами предварительный рост проводимости НТ перед делением при добавлении ГТФ к НТ после динамина (см. рис. 8а).

Рис. 10. Механизм деления НТ динамином. а – НТ, сжатая жесткой динаминовой спиралью (жесткие участки отмечены черным цветом), серыми стрелками отмечен виток, гидролизующий ГТФ. б – в результате гидролиза ГТФ один из витков перестал плотно контактировать с соседними (отмечен серым цветом). в – оставшиеся жесткими участки спирали не успевают разойтись, прежде чем число гидролизовавших ГТФ витков увеличится ( на рис. б они отмечены серыми стрелками), после этого происходит расширение НТ. г – оставшиеся жесткими участки спирали расходятся, в результате чего НТ локально сужается и формирует структуру полуделения, которая приводит к полному делнию НТ.

Энергия, необходимая для сжатия НТ до rc сравнима с энергией, выделяемой в результате кооперативного гидролиза ГТФ динаминовой спиралью (см. выше). Таким образом, можно сказать, что динаминовая спираль работает по принципу заводного механизма. Выделяемая в процессе самосборки белком энергия идет на деформацию мембраны НТ, а энергия гидролиза ГТФ расходуется на размыкание витков его спирали, динамин при этом возвращается практически в исходное состояние, когда он снова готов скручиваться и сжимать НТ.

Нами показана тесная взаимосвязь между динамином и липидным бислоем, что имеет биологическую значимость. Чувствительный к кривизне динамин будет полимеризоваться только на поверхности сильно изогнутых мембранных перешейков и будет регулировать их проводимость и/или делить их в зависимости от геометрических и механических параметров последних. Вариацией липидного состава перешейка можно управлять процессом его деления. В присутствии ГТФ динамин может существенно менять проницаемость перешейка, периодически сжимая – разжимая его, так что флуктуации его проводимости будут типа “kiss-and-run” (Newton et.

al., 2006). Суммируя все выше сказанное, мы можем сделать вывод о том, что “сотрудничество” динамина с липидными мембранами предоставляет клетке универсальный инструмент, позволяющий контролировать многие аспекты поведения мембранных НТ.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан метод определения механических параметров мембраны нанотрубки НТ (модуль изгиба, латеральное натяжение), основанный на анализе стационарной формы НТ, к концам которой приложена разность потенциалов. Показано, что жесткость многокомпонентной мембраны уменьшается с ростом ее кривизны. Это может быть связано с перераспределением липидных молекул, имеющих разное значение спонтанной кривизны, между внутренним и внешним монослоем мембраны. Когда радиус кривизны становится сравним с толщиной бислоя, модуль изгиба уменьшается вдвое.

2. Показано, что система, состоящая из отрицательно заряженной липидной нанотрубки и ГТФазы динамина, адекватно воспроизводит основные стадии деления клеточной мембраны. Динамин сжимает НТ, сорбируясь и формируя стабильную структуру на ее поверхности. Возможность деления НТ динамином в присутствии ГТФ определяется жесткостью ее мембраны, причем деление происходит без образования проводящих дефектов в стенке НТ.

3. Показано, что конформационные изменения динаминовой спирали в результате гидролиза ГТФ не вызывают ни дальнейшего ее сужения, ни увеличения ее шага. В действительности гидролиз ГТФ приводит к исчезновению стекинг-взаимодействия между витками спирали, они разъединяются, а спираль в итоге теряет жесткость.

Показано, что в физиологических условиях динамин формирует на поверхности НТ спирали, имеющие всего 3-5 жестких витков.

4. Радиус, до которого динамин сжимает НТ, является критическим параметром, определяющим возможность деления, а он в свою очередь зависит от модуля изгиба мембраны. Таким образом, нами показано, что молекулы липида наравне с динамином могут выполнять регуляторную роль в процессе деления клеточной мембраны.

5. На основе полученных данных было выдвинуто предположение о механизме деления НТ динамином. Согласно ему энергия гидролиза ГТФ расходуется на разъединение витков спирали динамина. Дальнейшая эволюция НТ зависит от радиуса, до которого она была сжата динамином, а также от длины участка спирали, гидролизовавшего ГТФ.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. П. В. Башкиров. “Мембранные нанотрубки в электрическом поле как система для измерения механических параметров липидного бислоя.” Биологические мембраны, 2007, том 24, № 2, с 183-192.

2. Bashkirov P. V. “Membrane Nanotubes in Electrical Field as a Model to Measure Mechanical Parameters of Lipid Bilayer” Biochemistry (Moscow), series A: Membrane and Cell Biology, 2007, Vol. 1, № 2, pp. 176-184.

3. Bashkirov P.V., Lizunov V. A., Zimmerberg J., Frolov V.A. “Membrane nanotubes pulled from planar BLM: membrane mechanics at very high curvatures.” // Biophysical Society’s 50-th Annual meeting, 18-22 Feb 2006, Salt Lake City, Utah, USA. Biophysical Journal, January 2006, Vol. 90, p. 784.

4. Frolov V. A., Bashkirov P. V., Lizunov V. A., Zimmerberg J. “Regulation of permeability through membrane nanotubes via shape transformation” // EMBO workshop on Cell Membrane Organization and Dynamics, 3-7 Jun 2006, Bilbao, Spain. Тезисы, стр. 18.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»