WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

r3 2lNT Общее решение однородной части (24) представляет собой гармоническую функцию, амплитуда которой экспоненциально затухает с характерной длиной, равной 2r. Частное решение уравнения (28) имеет вид:

C0U rz(x) = x(25).

2lNT K Таким образом, находим, что при наложении разности потенциалов к концам НТ, ее форму в первом приближении можно считать параболической. Следует отметить, что в этом случае сохраняется гиперболическая зависимость ее проводимости от длины. Сопротивление R такой трубки для z(x)<

lNT lNT dx 2z(x) lNT C0U r dx R = (26), 1- = 3K r2 r r2 1(r + z(x)) откуда видно, что оно линейно зависит от длины.

Теперь найдем связь между измеряемым радиусом rNT нанотрубки, ее механическими параметрами и прикладываемому к концам НТ напряжению. Во-первых, определяемый экспериментально радиус НТ (см. Экспериментальное определение радиуса НТ) соответствует радиусу люмена некоторого эффективного мембранного цилиндра, имеющего ту же проводимость и длину, что и НТ. Во-вторых, согласно уравнению (26) равновесный радиус нейтральной поверхности такого цилиндра reff будет зависеть от прикладываемого к концам НТ напряжения следующим образом:

1 1 C0U = - (27), reff r2 3K где r – равновесный радиус нейтральной поверхности цилиндрической НТ (когда U = 0), или, с учетом (20):

1 20 C0U = - (28).

reff K 3K И, в-третьих, как следует из уравнения (21), равновесный радиус эффективного цилиндра связан с измеряемым rNT выражением:

1 1 1 = + (29).

2 2 reff (rNT + a) (rNT + a + h) Здесь учтено, что ri = rNT + a, где a – толщина слоя полярных головок липидов во внутреннем монослое, равная 0.5 нм. Таким образом, окончательное выражение, связывающее измеряемый радиус люмена НТ с механическими параметрами БЛМ и прикладываемым напряжением, имеет вид:

1 1 40 2C0U + = - (30).

2 K 3K (rNT + a) (rNT + a + h) Следовательно, с ростом U должно происходить увеличение измеряемых значений радиусов НТ. Такая зависимость представлена на рисунке 4а. Построение зависимости левой части выражения (30), которая определяется экспериментально, от квадрата приложенного к НТ напряжения, как это изображено на рисунке 4б, дает возможность по углу наклона найти модуль изгиба K мембраны, а по точке пересечения с осью ординат - латеральное натяжение 0. Ниже приведена таблица найденных значений K и 0 для БЛМ различного липидного состава.

Из таблицы видно, что жесткость фосфолипидных БЛМ увеличивается с ростом концентрации в них холестерина. В то же время ее латеральное натяжение практически не меняется и равно примерно 1 дин/см, что совпадает с величиной, найденной методом выдувания (Черномордик и др., 1987). Однако модули изгиба мембран, измеренные нами на НТ, оказались в два раза меньше полученных на гигантских липосомах (Bo and Waugh, 1989; Rawicz et. al., 2000; Henriksen et. al., 2004;). Это несоответствие, скорее всего, вызвано тем, что радиусы структур, для которых определяют модули изгиба мембран, отличаются на порядки. Поэтому если мы имеем дело с многокомпонентной мембраной, и значение спонтанных кривизн этих компонент сильно различаются, как в случае ДОФХ и ДОФЭ (Leikin et. al., 1996; Chen and Rand, 1997), то липидные составы внешнего и внутреннего монослоев НТ будут разными.

Это, в свою очередь, должно приводить к уменьшению жесткости мембраны НТ (Kozlov and Helfrich, 1992). Что касается фосфолипидных мембран, содержащих лизолипид и холестерин, то, насколько нам известно, подобных измерений ранее не проводилось. Модуль изгиба таких мембран измерен нами впервые. Видно, что он аномально высок, что, скорее всего, связано с плотной упаковкой холестерина с лизолипидом в бислое. В работах (Ramsammy et. al., 1983) было показано, что они могут образовывать между собой водородные связи.

Рис.4. а – зависимость измеряемого rNT от приложенного к концам НТ напряжения. б – определение механических параметров бислоя из зависимости правой части уравнения (30) от квадрата приложенного к НТ напряжения.

ДОФХ:ДОФЭ 2:1 + Холестерин ДОФХ:ДОФЭ 2:1+Хол:ОФХ 1:Хол % K, Дж·10-20 Хол:ОФХ% K, Дж·10-, дин/см, дин/см 0 3.6 ± 0.3 1.2±0.4 0 3.6 ± 0.3 1.2±0.5 4.6 ± 0.6 1.0±0.2 10 12.8±1.6 0.9±0.10 5.8 ± 0.6 1.1±0.3 20 35.3±3.3 0.9±0.15 6.8 ± 0.7 1.1±0.2 40 76.4±5.6 0.8±0.Таблица 1. Зависимость механических параметров БЛМ от ее липидного состава.

Отметим, что зависимость радиусов НТ от концентрации лизолипидов и холестерина в бислое может иметь определенное биологическое значение. Согласно последним исследованиям внутриклеточного и межклеточного транспорта (Duman et.

al, 2003; Rustom et. al., 2004), цилиндрические мембранные образования играют важную роль в этом процессе. Эффективность такого транспорта зависит от проницаемости мембранных трубок, а значит, от их размеров. Можно предположить, что холестерин и лизолипид используются клетками в качестве модуляторов селективности клеточных мембранных НТ.

Исследование механизма деления клеточной мембраны в модельной системе «НТ + ГТФаза динамин».

Взаимодействие НТ с динамином. Для исследования деления мембранной НТ белком динамином, ее вытягивали из БЛМ, содержащих 15-30 % отрицательно заряженных липидов (фосфотидилсерин, ФС). Использовались мембраны двух липидных композиций - ДОФХ:ДОФЭ:ДОФС:Холестерин 27.5:27.5:15:30 и ДОФХ:ДОФЭ:ОФС:Холестерин 30:30:20:20, имеющих практически одинаковую плотность поверхностного заряда, но разное значение модуля изгиба, 17±3 kT и 150±20 kT соответственно, что позволяло получать НТ двух типов: с радиусом люмена 6.1±0.5 нм и 21±0.5 нм (далее такие трубки с r = 21 нм будем называть широкими или шНТ).

Для подтверждения факта адсорбции динамина на поверхность БЛМ, содержащих ФС, использовали метод измерения второй гармоники трансмембранного потенциала (см. Материалы и Методы). Было обнаружено, что регистрируемый эффект возникал только при высоком содержании ДОФС в мембране, более 80%. На рисунке 5а показано, что добавление динамина с одной из сторон БЛМ (ДОФС:Холестерин 85:15) в конечной концентрации 0.04 мг/мл приводит к возникновению трансмембранного потенциала равного 10 мВ; характерное время адсорбции составляло минуты. Эффект кратковременной аппликации динамина к поверхности БЛМ посредством перфузионной пипетки изображен на рисунке 5б; он демонстрирует, что процесс адсорбции белка на плоскую мембрану обратим.

Рис.5. а – возникновение трансмембранного потенциала на БЛМ (липидный состав ДОФС:Хол 85:15) при добавлении с одной из ее сторон динамина с конечной концентрацией 0.04 мг/мл, момент добавления белка отмечен стрелкой. б – обратимость сорбции динамина на БЛМ (липидный состав ДОФС:Хол 85:15). Динамин добавляли посредством перфузионной пипетки, концентрация белка в пипетке составляла 0.4 мг/мл. Время начала аппликации белка отмечено стрелкой вниз, время прекращения – стрелкой вверх.

Данные, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, свидетельствуют о том, что динамин сорбируется на поверхности НТ, мембрана которой содержит ДОФС. На рисунке 6а представлены последовательно сделанные фотографии НТ, вытянутой из гигантской униламелярной липосомы до добавления динамина и после кратковременной его аппликации. Липидный состав липосомы был таков:

ДОФС:ДОФХ:ДОФЭ:Хол:ДОФЭ-родамин 15:27.5:24.5:30:3, причем родамин использовался в качестве флуоресцентной метки. Из сравнения фотографий видно, что динамин сорбируется и формирует на поверхности НТ белковую структуру, которая сжимает трубку. Для исследования динамики этого процесса мы измеряли проводимость внутренних каналов НТ и шНТ.

Для определения эффекта, оказываемого динамином на геометрию НТ, мы добавляли его (концентрация 0.4 мг/мл) посредством перфузионной пипетки, которую подводили к НТ на расстояние не более 2 мкм (см. Материалы и Методы). Постепенное уменьшение проводимости свидетельствовало о сужении трубки, предположительно вызванным сжатием ее динаминовой спиралью. В течение десятков секунд проводимость достигала нового стационарного уровня (рис. 6б). В аналогичных эксперимен тах с шНТ характер изменения проводимости сохранялся, но только становился более медленным (см. рис 6б). Кроме изменения стационарного уровня проводимости, адсорбция динамина влияла на устойчивость НТ к уменьшению ее длины: так, если длину свободной НТ можно было укоротить практически до 0, то после аппликации динамина НТ рвалась (см. рис 6б) при достижении некоторой длины, отличной от 0.

Рост проводимости свидетельствовало том, что белок только частично покрывал поверхность трубки. После того как длина НТ достигала некоторого значения, дальнейшее укорочение становилось невозможным - трубка рвалась в ответ на механическое воздействие.

Рис.6.Поджатие НТ динамином. а - динамин добавили к флуоресцентно меченной НТ между 0 с и 5 с посредством перфузионной пипетки. Концентрация белка в пипетке 0.4мг/мл. Состав мембраны ДОФС:ДОФХ:ДОФЭ:Хол:ДОФЭ-родамин 15:27.5:24.5:30:3. Масштаб 5 мкм. б – уменьшение проводимости НТ (черная кривая) и шНТ (серая кривая) в результате кратковременной добавки к ним динамина; последующая попытка укоротить НТ приводит к ее разрыву (проводимость резко падает до фонового уровня Gbg). Правая ось ординат соответствует относительной проводимоG - Gbg сти нанотрубки, которая находится из соотношения Gотн =, левая ось ординат соотGinit - Gbg ветствует длине НТ (верхняя кривая справа от пунктирной линии), ось абсцисс – время, для НТ единица шкалы 1 с, а для шНТ 10 с.

Так как во время локальной перфузии белка степень покрытия нанотрубки динамином сильно варьировалась, в другой серии экспериментов НТ вытягивали в присутствии динамина (концентрация 4 мкМ) в растворе электролита. Показано, что в используемых концентрациях динамин не оказывал влияния на проводимость НТ.

Напротив, проводимость НТ начинала постепенно уменьшаться сразу после ее образования (см. рис 7а). Это подтверждает тот факт, что динамин собирается в спираль только на мембранах, имеющих достаточную кривизну (Yoshida et. al., 2004). После того как проводимость НТ достигает стабильного уровня, ее реакция на уменьшение длины НТ исчезает. Это свидетельствовало о том, что динамин полностью покрывал НТ, образуя на ее поверхности стабильную белковую спираль, способную навязывать НТ большую кривизну. При этом сохранялась возможность дальнейшего удлинения НТ (рис. 7б). После того как пэтч-пипетка отводилась от БЛМ, и, тем самым, вытягивался новый свободный участок НТ, динамин довольно быстро собирался на нем и сжимал его (рис. 7б). Зная длину вытянутого участка трубки (она в точности равнялась смещению пипетки), мы нашли, что независимо от его длины значение радиуса люмена, до которого сжималась НТ, составляло 2.5±0.5 нм (SD, n=4), в то время как для шНТ эта величина была равна 12±2 нм (SD, n=4). Соответственно, ди намин вызывал уменьшение проводимости нанотрубки в три раза (см. рис.8в, два левых столбца); усреднение проводилось по 15 экспериментам с НТ и 9 экспериментам с шНТ.

Меняя липидный состав мембраны, мы обнаружили, что конечный размер сжатой динамином нанотрубки зависит от жесткости мембраны. Это говорит о том, что энергия, выделяемая белком в процессе его полимеризации, не намного превосходит изгибную энергию НТ. Тем не менее, для сжатия нанотрубок до столь малых радиусов она должна быть существенной. В случае шНТ, найденное нами значение оказалось порядка 10 kBT на одну молекулу динамина. При вычислении мы предполагали, что упаковка динамина на поверхности шНТ аналогична той, что наблюдалась на нанотрубках того же размера в других экспериментальных системах(Zhang and Hinshaw, 2001). Таким образом, можно сделать заключение, что в отсутствии ГТФ динамин кластеризуется на поверхности липидных нанотрубок, формируя жесткую структуру, которая достаточно сильно их сжимает, причем степень поджатия определяется жесткостью их мембраны. Деления НТ без ГТФ не происходит.

Рис.7. а – влияние динамина на формирование НТ (динамин присутствует в растворе электролита в концентрации 0.04 мг/мл), серая кривая отображает поведение НТ в отсутствии белка, проводимость НТ нормирована относительно начальной проводимости. б – изменение проводимости сжатой динамином НТ после ее удлинения; пунктирная линия отмечает начало уменьшения проводимости НТ только за счет сжатия белком вновь вытянутого участка.

Взаимодействие НТ с динамином в присутствии ГТФ. Инициировать деление можно было ГТФ, который добавляли двумя способами: либо с помощью перфузионной пипетки после адсорбции динамина на НТ, либо введением в раствор электролита одновременно с динамином до формирования НТ (см. Материалы и Методы). В первом случае исследовали эффект, который оказывал гидролиз ГТФ на динаминовую спираль. Добавление нуклеотида к сжатым динамином НТ и шНТ приводило к быстрому росту их проводимости (см. рис. 8а). Относительная проводимость шНТ при этом обычно достигала нового стационарного уровня, который был ниже 1 (см. рис. 8в, центральная пара столбцов). Причем она быстро возвращалась к исходному значению после удаления ГТФ из раствора (см. рис. 8а). В 6 из 6 экспериментов деления шНТ после добавления ГТФ не наблюдалось, а НТ, напротив, в из 3 случаев рвалась. После предварительного роста ее проводимость мгновенно падала до 0, что и соответствовало ее разрыву. Время роста менялось от эксперимента к эксперименту, относительная проводимость НТ при этом успевала вырасти примерно вдвое (см. рис. 8в, центральная пара столбцов).

Структурный анализ на основе электронной микроскопии показал, что гидролиз ГТФ может приводить к изменению шага и/или радиуса динаминовой спирали, что согласно существующим предположениям, должно вызывать дальнейшее сужение и деление нанотрубки (Sweitzer and Hinshaw, 1998; Stowell et. al., 1999). Однако обнаруженный нами рост проводимости нанотрубки не вписывается в рамки этих предположений. Стоит отметить, что его скорость сравнима с наблюдаемыми трансформациями динаминовой спирали под воздействием гидролиза ГТФ. Действительно, рост проводимости вызван скорее изменением организации динамина в спирали, чем десорбцией его с мембраны, которая согласно ряду работ существенно медленнее (Tuma and Collins, 1995). Кроме того, сжимающая способность белковой спирали быстро восстанавливается после удаления ГТФ из системы (см. рис. 8а). Следовательно, изменения ее структуры все же происходят, но они не направлены на сужение НТ.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»