WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Использовалось два способа добавления динамина и ГТФ к мембранным нанотрубкам. В первом случае чистый динамин или динамин с ГТФ добавляли в раствор электролита до формирования НТ. Конечная концентрация белка и нуклеотида при этом была 0.04 мг/мл и 1мМ соответственно. Во втором случае динамин и ГТФ апплицировали непосредственно на НТ. Для этого их добавляли с помощью микропипеток, которые вплотную подводились к нанотрубкам. Одна из пипеток была заполнена раствором динамина в концетрации 0.4 мг/мл, другая, если было необходимо, ГТФ в концентрации 10 мМ. Разница гидростатического давления на границе кончика пипетки с раствором равнялась нулю, таким образом, могли существовать только диффузионные потоки белка или нуклеотида. Для локализации и определения размера диффузионного облака вокруг кончика пипетки мы добавляли в раствор внутри пипетки флуоресцентно меченые 40-ка нанометровые полиэтиленгликоливые шарики (биды). Пипетки с динамином и ГТФ подводили к НТ так, чтобы НТ оказывалась внутри окрашенной диффузионной области. Когда это было необходимо, пипетки отводились от НТ, и объемные концентрации белка или ГТФ около НТ довольно быстро становились пренебрежимо малыми.

Измерение адсорбции динамина на поверхности БЛМ.

Метод, который мы использовали для исследования адсорбции динамина на БЛМ, основан на электрострикции мембраны (Соколов и Кузьмин, 1984), в результате которой ее емкость C квадратично зависит от трансмембранного потенциала U:

C = C0 +U (I).

Если динамин сорбируется на поверхность отрицательно заряженной мембраны, то его добавление только с одной стороны симметричной БЛМ приведет к возникновению трансмембранного напряжения Vt на ней, так как белок скомпенсирует часть отрицательного заряда на одной из сторон БЛМ и нарушит равенство поверхностных зарядов ее монослоев. Прикладывая при этом к мембране переменное электрическое поле U0sin(t) и измеряя амплитуду второй гармоники емкостного тока, находим значение Vt согласно уравнению:

I2 = U0Vt sint (II), которое получено в предположении, что >> 1.

Мы использовали генератор сигнала низких частот модель ГЗ – 102 (СССР) для прикладывания переменного синусоидального напряжения к БЛМ с, = 300 Гц, и U0 = 300 мВ; пэтч-кламп усилитель EPC-7 (“Heka”, Германия) использовали для компенсации емкости мембраны C0 и измерения емкостного тока, который, в свою очередь, шел на вход фазочувствительного усилителя LI-575 (Synchotrach, Япония).

Полученный с выхода фазочувствительного усилителя сигнал, соответствующий амплитуде тока второй гармоники, оцифровывали и записывали на жесткий диск компьютера с помощью АЦП L-305/L-1210 (“L-card”, Россия). В начале каждого эксперимента, перед добавлением динамина, снималась калибровочная зависимость Vt от амплитуды I2, которая аппроксимировалась линейной функцией. Для этого наряду с переменным напряжением U0sin(t) к мембране прикладывали постоянную разность потенциалов Vt, которую варьировали от -50 до 50 мВ с шагом 5 мВ. Таким образом, после аппликации динамина, согласно измеренному значению амплитуды тока второй гармоники, находили величину трансмембранного напряжения, возникающего за счет адсорбции динамина.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Связь равновесного радиуса НТ с механическими параметрами БЛМ.

Для нахождения значения равновесного радиуса НТ решали задачу о минимизации функционала свободной поверхностной энергии мембранного цилиндра, связанного с резервуаром липида (мениском) и имеющего постоянную длину lNT. В нашем случае связь НТ с мениском осуществлялась посредством плоской БЛМ, а длина НТ определялась положением кончика пипетки. Согласно предварительным оценкам, радиусы вытягиваемых из БЛМ нанотрубок сравнимы с толщиной бислоя (Frolov et. al., 2003), поэтому свободную энергию НТ находили как сумму свободных энергий ее внутреннего и внешнего монослоя. На рисунке 2 представлено схематическое изображение НТ в виде двух коаксиальных бесконечно тонких цилиндров, соответствующих нейтральным поверхностям внутреннего и внешнего монослоев НТ. Расстояние между этими цилиндрами фиксировано и равно h – толщине гидрофобной прослойки мембраны.

Согласно приближению Хельфриха (Helfrich, 1973), функционал свободной поверхностной энергии мембраны W зависит от числа молекул поверхности мембраны n, площади поверхности A и ее кривизны J:

W = W(n, A, J ) (1), Вариация энергии, соответственно, имеет вид:

dW = µdn + dA + BdJ (2), где µ – химический потенциал молекулы в мембране, – латеральное натяжение мембраны, а B - действующий на нее изгибающий момент, который Рис.2. Схематическое изображение мембранной НТ, представленной в виде двух коаксиальных бесконечно тонких цилиндров одинаковой длины lNT, соответствующих внешнему и внутреннему монослою НТ, радиусы которых равны, соответственно, re и ri.

для малых отклонений кривизны J от своего спонтанного значения J0 определяется выражением B = Ak(J - J0), где k – модуль изгиба монослоя. В тоже время из экстенсивности W, n и A следует, что:

W = µn + A (3).

Из уравнений (2) и (3) получаем:

k µ = µ0 + a0 (J - J0) - a(4), где µ0 – стандартный химический потенциал молекулы липида, а a0 – площадь, приходящаяся на одну молекулу липида. В соответствии с уравнениями (3) и (4) выражение свободной поверхностной энергии НТ, изображенной на рисунке 2, будет иметь вид:

k k 2 W = µ0ni + µ0ne + Ai (Ji - J0 ) + Ae (Je - J0 ) + µN (5), 2 где нижний индекс i соответствует внутреннему монослою, e – внешнему, а N – число молекул в мениске, для которого выполняется соотношение:

N + ni + ne = N0 = const (6).

Путем несложных преобразований с использованием выражений (4) и (6) уравнение (5) можно переписать в ином виде:

k k k k 2 2 W = Ai + Ae - Ai J0 - Ae J0 + Ai (Ji - J0) + Ae (Je - J0) + µN(7), p p 2 2 2 где латеральное натяжение плоского монослоя p дается формулой:

µ0 - µ k = + J(8).

p a0 Для цилиндра A = 2rlNT, Ji = -1/ri и Je = 1/re, где ri и re – радиусы внешнего и внутреннего монослоя НТ, причем re - ri = h = const. В равновесии dW = 0, так что варьирование выражения (7) по ri, позволяет получить соотношение, определяющее связь внутреннего радиуса НТ с механическими параметрами мембраны:

1 1 + = (9), ri2 K (ri + h) где 0 = 2p – натяжение бислоя, K = 2k – модуль изгиба бислоя, а h – его толщина.

Из уравнения (9) видно, что значение внутреннего радиуса НТ не зависит от значения спонтанной кривизны монослоев мембраны.

Экспериментальное определение радиуса НТ. Зависимость радиуса НТ от липидного состава БЛМ.

Для точного определения значения радиуса мембранной нанотрубки проводили анализ зависимости проводимости НТ от ее длины. Измеряемая в эксперименте проводимость G состоит из проводимости нанотрубки GNT и фоновой проводимости Gbg, связанной с электрической утечкой в месте контакта мембраны со стеклянной пэтч-пипеткой и проводимостью плоской БЛМ (см рис.1), G = GNT + Gbg. Длина нанотрубки lNT равна разности между измеряемым вертикальным смещением кончика пипетки L относительно его самого нижнего положения (смотри материалы и методы) и параметром Lbg, равным расстоянию между плоской БЛМ и самым нижним положением кончика пипетки, lNT = L – Lbg. Считая, что форма НТ слабо отличается от цилиндрической и предполагая, что при движении пипетки меняется только lNT, мы аппроксимировали экспериментальную зависимость G от L гиперболической функцией, следующего вида:

G = + Gbg (10), L - Lbg rNT здесь - проводимость НТ единичной длины, =, где - удельное сопротивле ние раствора электролита, а rNT – радиус люмена НТ (далее – просто радиус НТ). Из найденного в процессе аппроксимации параметра и определяли значение радиуса НТ. Для 100 мМ раствора KCl удельное сопротивление равно 1 Ом·м.

На рисунке 3а приведены экспериментальная зависимость проводимости НТ от ее длины и аппроксимирующая эту зависимость функция, построенная по формуле (10). Для всех имеющихся данных эта функция хорошо описывала подобную зависимость – среднеквадратичное отклонение не превышало 5 пС. Погрешность аппроксимации составляла 0.4 пС, доверительная вероятность 0.99. В каждом отдельном эксперименте погрешность определения радиуса НТ не превышала 5%. Было показано, что радиусы НТ, вытянутых из одной и той же БЛМ, не различались в пре делах погрешностей, что было ожидаемым, так как согласно формуле (9) равновесное значение rNT определяется исключительно механическими параметрами бислоя.

Кроме того, было найдено, что в пределах используемых скоростей движения пипетки (от 0.05 мкм/c до 0.4 мкм/с) разброс вычисляемых значений радиусов НТ не превышал точности их определения, что говорит о квазистационарности процесса изменения длины НТ на таких скоростях.

Рис.3. а – аппроксимация экспериментальной зависимости проводимости G от положения кончика пипетки L гиперболической функцией (10). Точки соответствуют дискретным моментам регистрации G и L. Сплошной линией изображена аппроксимирующая функция, при = 60.8 пСм/мкм, Lbg = 11.1 мкм, Gbg = 1.7 пСм. б – радиус НТ, вытянутых из фосфолипидных мембран (ДОФХ:ДОФЭ 2:1) с разным содержанием холестерина (кривая 1); радиус НТ, вытянутых из фосфолипидных мембран (ДОФХ:ДОФЭ 2:1) с разным содержанием смеси холестерин:ОФХ 1:(кривая 2); по оси абсцисс отложена концентрация холестерина в БЛМ, а по оси ординат радиус НТ.

Используя разработанный метод определения радиусов НТ, мы провели исследование влияния липидного состава на значения радиуса. Все эксперименты проводились в эквивалентных условиях (t = 250С, 100 мМ KCl, pH = 7.0, прикладываемое к концам НТ напряжение U = 50 мВ). Минимальным радиусом обладали НТ, которые вытягивались из мембран, состоящих только из фосфолипидов ДОФХ:ДОФЭ в соотношении 2:1. Среднее значение радиуса таких НТ составляло всего 2 нм. Однако размер НТ существенно увеличивался при добавлении к таким мембранам холестерина. На рисунке 3б кривая 1 отображает зависимость радиуса НТ от мольной концентрации холестерина в фосфолипидной мембране. Увеличение радиуса НТ с ростом концентрации холестерина в мембране, в первую очередь, вызвано тем, что холестерин, как это хорошо известно, увеличивает модуль изгиба фосфолипидных мембран за счет конденсирующего эффекта, оказываемого им на жирнокислотные хвосты липидов. Добавка к фосфолипидным мембранам смеси лизолипид:холестерин в соотношении 1:1 приводила к еще более значительному росту радиуса НТ, вытягиваемых из таких мембран. На кривой 2 рисунка 3б представлены значения, которые принимает радиус НТ, в зависимости от содержания смеси ОФХ:Холестерин 1:1 в фосфолипидной мембране ДОФХ:ДОФЭ 2:1. Радиус НТ, состоящей на 80 % из лизолипида и холестерина, составляет 20 нм, что в десять раз больше радиуса фосфолипидной НТ. Таким образом, добавка смеси лизолипида с холестерином к фосфолипидным мембранам приводит к существенному увеличению диапазона радиусов, вытягиваемых из БЛМ нанотрубок. Так, варьируя липидный состав БЛМ, мы показали, что радиус НТ может принимать значения от 2 до 20 нм.

Влияние электрического напряжения, приложенного к концам НТ, на ее размер, форму и проводимость. Измерение механических параметров НТ.

В нашей системе для определения радиуса НТ нужно проводить измерения текущего через нее электрического тока, для чего необходимо прикладывать разность потенциалов U к НТ. Здесь стоит отметить, что в экспериментальной системе, которая отображена на рисунке 1, разность потенциалов на БЛМ равна прикладываемой к электродам (мы не учитываем сопротивление пипетки). Дело в том, что электрическое сопротивление в месте контакта мембраны со стеклянной пипеткой много меньше сопротивления самой мембраны и мениска. Таким образом, трансмембранный потенциал меняется вдоль НТ от 0 у кончика пипетки до прикладываемого значения U у плоской БЛМ. Согласно уравнению электрокапилярности Липпмана:

C0Vt = 0 (11), где – натяжение БЛМ, а C0 – ее удельная емкость. Как следует из уравнения (II), электрическое поле приводит к уменьшению латерального натяжения мембраны НТ вдоль трубки. Таким образом, форма НТ будет отклоняться от цилиндрической согласно формуле (9). Для нахождения новой формы НТ снова решали вариационную задачу о нахождении минимума функционала ее свободной поверхностной энергии.

Единственное отличие здесь заключается в том, что мембрану представляли не в виде двух коаксиальных цилиндров, а в виде одного с нейтральной поверхностью, лежащей на границе раздела монослоев. Это связано с тем, что трансмембранный потенциал невозможно “поделить” между монослоями. Для симметричной мембраны J0 = 0, поэтому выражение свободной поверхностной энергии dW элемента мембраны площадью dA будет иметь вид:

C0Vt2 K dW = - (12), 0 2 dA + 2 J dA здесь K – модуль изгиба бислоя. В предположении, что C0Vt2 << 0 (это верно вплоть до 200 мВ, так как латеральное натяжение БЛМ около 1дин/см, а удельная емкость мкФ/см2), отклонение формы НТ от цилиндра будет малым. Введем значение радиуса НТ как функцию y(x), где x – координата вдоль оси НТ:

y(x) = r + z(x) (13), где r – радиус нейтральной поверхности бислоя, а z(x) – малое отклонение от него.

Тогда элемент площади нейтральной поверхности НТ будет равен:

dA = 2y(x) 1+ (y (x)) dx (14), а кривизна будет определяться выражением:

1 y (x) J (x) = (15).

y(x) 1+ (y (x)) (1+ (y (x)) ) Распределение напряжения вдоль НТ будет иметь вид:

x -(r + z(q)) dq Vt (x) = U (16), lNT -(r + z(q)) dq откуда видно, что Vt(0) = 0, а Vt(lNT) = U. Свободная энергия всей НТ записывается как:

lNT lNT dW W = dx = f (x)dx (17), dx 0 и минимизируется с помощью стандартного уравнения Эйлера-Лагранжа:

f d f d f - + = (18).

z dx z dx2 z Раскладывая функцию f(x) по z(x) до второго порядка и предполагая, что Vt(x) не зависит от формы трубки, получаем дифференциальное уравнение:

K K C0Vt2(x) K 0 - + z(x) - -0rz (x) + z (x) + Krz(4)(x) = (19).

2r2 r3 2 2r Если в уравнение (19) подставить z(x) = 0 и Vt(x) = 0, то получившееся соотношение будет определять связь равновесного радиуса нейтральной поверхности НТ с механическими параметрами БЛМ:

1 = (20).

r2 K Выражение (20) очень похоже на (9), и если учесть, что 0 = 2p, а K = 2k, то легко получить уравнение, связывающее внутренний радиус НТ и радиус r нейтральной поверхности:

1 1 1 = + (21).

r2 2 ri(ri + h) Подставляя (20) в (19) получаем:

Kz(x) C0Vt2(x) Krz(4) (x) + - = (22).

r3 Разложение Vt(x) имеет вид:

lNT x Ux 1- z(q)dq + 2 z(q)dq Vt (x) (23).

lNT xr lNT r 0 Не учитывая члены следующего порядка малости типа U2z(x), оставляем в скобках из выражения (23) только 1; после подстановки (23) в (22) получаем уравнение, определяющее форму НТ:

Kz(x) C0U xKrz(4) (x) + - = (24).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»