WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |
на правах рукописи УДК 577.3 БАШКИРОВ ПАВЕЛ ВИКТОРОВИЧ Деление мембранных нанотрубок, опосредованное белком динамином.

Специальность 03.00.02. – биофизика автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2007 Работа выполнена в Институте физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН.

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук Юрий Александрович Чизмаджев.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Константин Вольдемарович Шайтан, доктор физико-математических наук Валерий Иванович Иванов.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Защита состоится «» г. в _ час. _ мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте по адресу:

141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., д. 9, МФТИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «» _ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук В. Е. Брагин 2 Введение. Актуальность исследования.

Деление клеточной мембраны – это такое топологическое преобразование, в результате которого происходит формирование новых мембранных структур. Оно лежит в основе фундаментальных клеточных процессов, таких как митоз, эндоцитоз, деление органелл и многих других. Для сохранения замкнутости объемов делящихся структур деление соединяющего их мембранного перешейка должно сопровождаться формированием, так называемой, структуры полуделения (Kozlovsky and Kozlov, 2003), когда внутренний монослой перешейка локально сливается, а внешний остается интактным. Эти перестройки сопряжены с большими изгибными деформациями мембраны. В клеточных системах они создаются специализированными белковыми структурами, собирающимися на поверхности перешейка (Lee amd Schekman, 2004), который при этом зачастую представляет собой цилиндрическую мембранную нанотрубку (НТ) (Lollike and Lindau, 1999).

Динамин является одним из ключевых белков, опосредующих деление мембран в различных клеточных системах (van der Bliek and Meyerowitz, 1991; Chen et.

al., 1991). Существуют предположения, что именно он за счет энергии гидролиза ГТФ разрывает мембранную НТ, деформируя ее соответствующим образом (Sever et.

al., 2000). Блокировка ГТФазной активности динамина in vivo приводит к остановке эндоцитоза на стадии деления мембраны. При этом хорошо видно, что белок образует плотные полимерные спирали или стопки колец вокруг мембранных НТ, удерживающих отпочковывающиеся везикулы (Takei et. al. 1995). Известно, что такая полимеризация запускает кооперативный гидролиз ГТФ (Tuma and Collins, 1995), так что его скорость увеличивается в тысячи раз, причем молекулы белка одной спирали практически одновременно гидролизуют ГТФ. Считается, что выделяющаяся при этом энергия расходуется на деформирование и деление мембранной НТ (Song and Schmid, 2003). О механизме превращения химической энергии в механическую работу известно мало, при этом существующие на сегодняшний день представления зачастую противоречивы. Большинство из предложенных гипотез были основаны на результатах анализа взаимодействия динамина с модельными липидными мембранами. Динамин проявляет механическую активность in vitro: так было показано, что он формирует длинные НТ из липидных везикул, навиваясь вокруг них спиралью (Carr and Hinshaw, 1997). При последующем добавлении в систему ГТФ происходит расщепление НТ на небольшие липосомы (Sweitzer and Hinshaw, 1998). Предполагают, что расщепление нанотрубок в таких системах происходит в результате структурных изменений динаминовой спирали, таких как ее сужение, удлинение или скручивание (Sweitzer and Hinshaw, 1998; Stowell et. al., 1999; Roux et. al., 2006). Однако до сих пор остается неразрешенным вопрос, каким образом такие трансформации спирали обеспечивают быструю, локальную и безутечечную перестройку бислоя, необходимую для формирования везикул.

В клетке динамин функционирует в присутствии ГТФ. Протяженные динаминовые структуры, которые образовывались in vitro на поверхности НТ (Takei et. al., 1995), формируются in vivo только при блокировании гидролиза ГТФ. Следовательно, функциональная белковая единица, опосредующая деление, относительно коротка и нестабильна. К сожалению, высокая скорость деления и низкая разрешающая способность использующихся экспериментальных методов серьезно усложняют идентификацию деформаций НТ, вызываемых динамином. Дело в том, что элек тронная микроскопия, которая являлась важнейшим инструментом в исследовании взаимодействия динамина с мембранами, даёт статическую картину и не позволяет следить за делением в режиме реального времени.

В нашей лаборатории была разработана методика вытягивания липидных трубок из плоской бислойной липидной мембраны (БЛМ) с помощью стеклянной микропипетки (Frolov et. al., 2003). Было показано, что в зависимости от длины трубки она может находиться в одной из двух форм: катеноидальная микротрубка (МТ) или цилиндрическая нанотрубка. Особенности формирования таких трубок позволяют вести непрерывное наблюдение за изменениями ионной проводимости их внутренних каналов. Поэтому, полученные таким образом НТ могут быть использованы для исследования быстрых процессов деления мембран динамином. Учитывая ключевое значение динамина в широком круге клеточных процессов, детальное изучение данной проблемы представляется весьма актуальным.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании механизма деления клеточных мембран с использованием модельной системы “липидная нанотрубка (НТ) – клеточный белок деления динамин”. В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1) Расширить экспериментальные возможности метода формирования мембранных НТ. Разработать способ измерения равновесного радиуса НТ. Исследовать его зависимость от липидного состава мембраны НТ. Разработать метод определения модуля изгиба и латерального натяжения мембраны НТ.

2) Исследовать взаимодействие динамина с НТ. Найти необходимые условия, при которых происходит сорбция динамина на НТ. Для исследования сорбции использовать метод второй гармоники и флуоресцентную микроскопию. Выяснить, как динамин влияет на радиус и стабильность НТ, имеющих разный модуль изгиба мембраны.

3) Исследовать особенности процесса деления НТ динамином в присутствии ГТФ.

Выяснить, что происходит с динаминовой спиралью в результате гидролиза ГТФ.

Проверить, протекает ли деление НТ в данной модельной системе без утечки.

4) На основе анализа полученных и литературных данных предложить и обосновать механизм деления НТ динамином.

Новизна исследования и его научно-прикладное значение.

В процессе выполнения работы были разработаны экспериментальные методы, позволяющие проводить измерения как геометрических размеров липидных нанотрубок (радиус и длину), так и механических параметров ее мембраны (модуль изгиба и латеральное натяжение), а также изучать их зависимость от липидного состава мембраны. Данные методы отличаются от встречающихся в литературе тем, что дают возможность исследовать характеристики сильно изогнутых мембран, радиус кривизны которых сравним с их толщиной. Практическая ценность этих методов заключается в том, что они позволяют делать оценки жесткости мембран наноскопических липосом, все шире используемых в медицине в качестве переносчиков лекарств.

Было показано, что варьированием липидного состава или значения, прикладываемого к мембранной трубке электрического напряжения, можно менять геометрический размер НТ. Обнаруженные свойства мембранных трубок важны для выяснения роли липидного бислоя в управлении процессами экзо- и эндоцитоза.

Впервые исследована кинетика взаимодействия НТ с клеточным белком динамином. При физиологических значениях концентраций, динамин за время ~ 10 с сжимает НТ до радиусов, сравнимых с толщиной липидного монослоя, что существенно меньше, чем предполагалось ранее. Показано, что радиус, до которого динамин сжимает НТ, определяет возможность ее деления белком в присутствии ГТФ и регулируется жесткостью мембраны. Впервые сделана оценка энергии, выделяемой динамином при полимеризации в спираль: она оказалась сравнима с энергией, выделяемой при гидролизе ГТФ.

Показано, что вопреки существующим предположениям гидролиз ГТФ не приводит ни к увеличению шага белковой спирали, ни к ее дальнейшему сжатию. Мы считаем, что в результате гидролиза ГТФ происходит лишь разъединение ее витков, вследствие чего спираль теряет жесткость. Показано, что в зависимости от первоначального радиуса и длины участка спирали, гидролизовавшего ГТФ, возможно как расширение, так и сужение с последующим делением НТ.

Полученные данные позволяют не только ответить на многие вопросы, связанные с делением мембранных НТ динамином, но и судить о роли липидного бислоя в этом процессе. Они заставляют пересмотреть существующие на сегодняшний день предположения о самом механизме деления мембран динамином и конформационных изменениях белка, происходящих при этом.

Апробация диссертационной работы.

Основные результаты, изложенные в диссертационной работе, докладывались и обсуждались на конференции молодых ученых ИФХЭ РАН (2007); на конференции “Laboratory of Cellular and Molecular Biophysics Annual Scientific Retreat” (Бетесда, США; 2006, 2007), на 50-ом съезде американского биофизического общества (Солт-Лейк Сити, США; 2006), на международной конференции “EMBO workshop on Cell Membrane Organization and Dynamics” (Бильбао, Испания; 2006) и на научных семинарах лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН (Москва; 2004-2007).

Публикации.

Основные положения диссертационной работы опубликованы в 5 печатных работах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, глав результатов работы и их обсуждения, выводов. Работа изложена на страницах, включает иллюстраций. Библиография включает работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Формирование мембраны.

Бислойную липидную мембрану (БЛМ) формировали по методу РудинаМюллера на 100 мкм отверстии в тефлоновой пленке, разделяющей два отсека специальной ячейки, заполненной электролитом (0.1 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH 7.0).

Отверстие обрабатывалось раствором фосфолипидов (“Avanti Polar Lipids Inc.”, США) в смеси октан/декан 1/1 (оба “Sigma”, США) в концентрации 10 мг/мл и высушивалось в аргоне. После погружения ячейки в раствор электролита на отверстие кисточкой наносилась капля раствора фосфолипидов в сквалане (“Sigma”, США) с концентрацией 10-30 мг/мл, из которой в течение нескольких минут спонтанно образовывалась БЛМ. При этом растворитель и лишний липид уходили в объёмную фазу, окружающую БЛМ, – мениск. В экспериментах использовались следующие фосфолипиды: 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфолхолин (ДОФХ), 1-олеоил-2-гидрокси-snглицеро-3-фосфохолин (ОФХ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ДОФЭ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фософсерин (ДОФС), 1-олеоил-2-гидрокси-sn-3фосфосерин (ОФС), флуоресцентно меченый 1,2-диолеоил-sn-3-фосфоэтаноламинN-(лизамин родамин B сульфонил) (ДОФЭ-Родамин) и холестерин в соотношениях, указанных в тексте.

Формирование мембранных трубок.

Для формирования и исследования электрических свойств мембран и мембранных трубок использовали установку (рис.1), состоящую из пэтч-пипетки, универсального генератора PAR-175 (“Princeton Applied Research”, США), пэтч-кламп усилителя EPC-7 (“Heka”, Германия), четырехполосного фильтра F-900 (“Frequency Devices”, США) и осциллографа OS-1420 (“GOULD”, Англия). Для изменения положения пипетки использовали контроллеры движения Model 860-C2 (“Newport”, США) и микроконтроллер движения Model ESA-CSA (“Newport”, США), последний - для высокоточного (шаг 50 нм) перемещения по вертикали. В процессе формирования БЛМ на хлорсеребряные электроды посредством пэтч-кламп усилителя подавался пилообразный сигнал с генератора и измерялся емкостной ток мембраны в режиме фиксации потенциала. Процесс образования липидного бислоя фиксировался по резкому увеличению емкости и одновременно по исчезновению изображения в микроскопе (толщина БЛМ ~ 4нм – много меньше длины волны видимого света). Затем с помощью микроманипулятора к мембране подводили пэтч-пипетку, так что между кончиком микропипетки и мембраной формировался плотный контакт (сопротивление контакта 1—10 Гом) (рис. 1б), что было видно по резкому уменьшению емкостного тока. Для разрушения мембраны под пипеткой скачком менялось гидростатическое давление, что приводило к появлению тока проводимости. После этого, отводя пипетку от плоской мембраны, вытягивали мембранную трубку (рис. 1в,г). Затем к электродам прикладывали постоянную разность потенциалов, и измеряли ток проводимости через мембранную трубку. Плавное изменение длины трубки осуществлялось с помощью микроконтроллера. Показания индикатора микроконтроллера, значения приложенного к концам трубки электрического напряжения и измеряемого тока через нее оцифровали и записывали на жесткий диск компьютера с помощью АЦП L-305/L-1210 (“L-card”, Россия). Частота опроса 1кГц. Сигнал предварительно пропускали через фильтр низких частот F-900; частота среза 0,5 кГц. Показания микроконтроллера позже пересчитывались в значение вертикального смещения кончика пипетки L относительно своего низшего положения с помощью построенной для этой цели калибровочной кривой.

Рис. 1. Формирование мембранной нанотрубки (НТ). а – плоская БЛМ. б – формирование плотного контакта между пэтч-пипеткой и БЛМ с последующим разрушением мембраны под пипеткой. в- формирование мембранной катеноидальной микротрубки (МТ) в начале отведения пипетки от БЛМ. г – образование мембранной НТ в результате коллапса МТ при достижении критической длины.

Для визуализации НТ использовали флуоресцентную микроскопию (рис. 6а) на основе инвертированного микроскопа Olympus IX-70 (Olympus Inc., Япония). В этом случае НТ вытягивали пэтч-пипеткой из гигантских однослойных липосом (ГОЛ), содержащих 3 мольных % ДОФЭ-Родамина. ГОЛ получали методом электроформации (Ангелова) на платиновых электродах в 200 мМ растворе глюкозы и 10 мМ Hepes при pH = 7,0. После образования ГОЛ на электродах этот раствор с помощью перфузионного насоса меняли на раствор электролита (100 мМ KCl и 10 мМ Hepes, pH = 7,0). Изображение НТ снималось и записывалось на жесткий диск компьютера с помощью CCD-камеры (Intesified VE1000SIT MIT, США).

Аппликация динамина и ГТФ.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»