WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Trichinella 32 58 Оpisthorchis 510 27 Echinococcus 106 51 Toxocara 223 14 Все исследованные антигены оказались способными связывать C1q и активировать оба пути комплемента. Соотношения в эффективности антигенов трихинелл, описторхисов, эхинококков и токсокар, в связывании C1q приблизительно соответствовали 5:7:3:3, в активации классического пути – 6:3:5:1 и альтернативного пути – 1:16:3:7. Активация комплемента не только приводит к лизису клеток, несущих антиген, но и к включению других защитных систем организма хозяина – выбросу цитокинов, инициированию реакции воспаления, лейкоцитозу. Полученные данные свидетельствуют о вероятном участии комплемента в защите от паразитарных инвазий.

Иммуноферментный метод определения комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов На сегодняшний день существует множество методов определения ЦИК, различных по сложности и стоимости. Однако практически все методы плохо согласуются между собой, и часто рекомендуется использовать несколько из них (Van Hoeyveld E., 2000).

В данной работе предложен иммуноферментный метод определения ЦИК, основанный на способности иммунных комплексов связывать компонент C1q комплемента. В предлагаемом методе иммуноферментный планшет покрывали моноспецифическими поликлональными кроличьими антителами против C1q человека. Иммунные комплексы, опсонизированные C1q, из сыворотки крови связываются с сорбированными антителами, и их количество определяли с помощью конъюгатов с пероксидазой антител против IgG, IgM или IgA.

В работе проводится сравнение предлагаемого метода с наиболее применяемыми в настоящее время, и обсуждаются возможные причины наблюдаемых различий результатов определений реальных ЦИК.

Из многих имеющихся на сегодня методов определения ЦИК в нашей стране наиболее распространен в клинической практике метод обнаружения комплексов, осаждаемых полиэтиленгликолем и измеряемых по светорассеянию (далее метод ПЭГ). За рубежом популярны иммуноферментные методы анализа (ИФА), основанные на связывании C1q-несущих ЦИК с мышиными моноклональными анти-C1qантителами, сорбированными в лунках микропанели, c детектированием мечеными пероксидазой F(ab’)-антителами к IgG человека (далее MAb-C1q метод). Иногда и у нас и за рубежом используют метод ИФА, в котором для связывания ЦИК на микропанели сорбируют C1q. Одной из разновидностей последнего метода является коммерческий набор CIC-C1Q ELISA (Bhlmann Laboratories AG, Швейцария), строго говоря, не являющийся иммуноферментным (далее метод CIC-C1Q). Он основан на связывании ЦИК с сорбированным на микропанели C1q и оценке количества связавшихся иммунных комплексов с помощью конъюгата белка А с щелочной фосфатазой.

Для получения адекватных результатов определения комплементсвязывающих ЦИК с использованием более дешевых реагентов был предложен рассматриваемый здесь метод. Он основан на связывании C1q-несущих ЦИК с кроличьими моноспецифическими поликлональными анти-C1q-антителами, сорбированными в лунках микропанели, c детектированием мечеными пероксидазой козьими моноспецифическими поликлональными антителами к IgG (IgM или IgA) человека (далее анти-C1q метод).

Методом анти-C1q было проведено определение содержания ЦИК в сыворотках здоровых доноров крови и больных ревматоидным артритом. Результаты определения приведены в таблице 7.

Табл. 7. Результаты определения комплементсвязывающих ЦИК у доноров крови и больных ревматоидным артритом (РА).

Параметр Доноры Больные РА Среднее ± станд. откл., мкг/мл 7 ± 12 47 ± Максимум, мкг/мл 35 Норма (ср. + 2 ст.откл.), мкг/мл до Число сывороток 24 Превышение нормы, чел. (%) 2 (8%) 14 (70%) По литературным данным (Reckel R.P., 1984), среднее содержание ЦИК у нормальных доноров крови составляет 3.8 ± 15.3 мкг/мл, а норма (ср. + 2 ст. откл.) до мкг/мл. Результаты, полученные предлагаемым анти-C1q методом (7 ± 12 мкг/мл и до 31 мкг/мл), практически совпадают с литературными.

По литературным данным, повышенное содержание ЦИК обнаруживается у 86% или 81.1% (Antes U., 1991) больных РА при определении по MAb-C1q методу, 77.2% (Hakov V., 1978) при определении с осаждением ПЭГ и 67% (Antes U., 1987) при использовании метода ИФА, в котором для связывания ЦИК применяли сорбированный C1q.

Следует отметить, что метод MAb-C1q может давать завышенные результаты, поскольку в крови человека могут присутствовать антитела к иммуноглобулинам мыши (Olds L.C., 1984). Можно также ожидать завышения результатов при использовании ПЭГ метода из-за возможного осаждения помимо ЦИК других высокомолекулярных комплексов и белков. Таким образом, данные, полученные предлагаемым анти-C1q методом (70%) приближаются к данным, в которых отсутствует завышение определяемых ЦИК.

Предлагаемый метод анти-C1q был проверен сравнением с ПЭГ методом на модельных ЦИК (термически агрегированных неспецифических IgG человека), опсонизированных C1q (рис. 4). Было найдено полное совпадение результатов. Следует отметить, что определение модельных ЦИК, опсонизированных C1q, коммерческим методом CIC-C1Q дает при линейной калибровочной линии существенно заниженные результаты (рис. 5).

y = 0,9999x + 1,анти-C1q 7,R = 0,y = 0,013x + 2,y = 0,9999x + 0,ПЭГ R = 0,R = 0,6,5,4,3,-50 0 50 100 150 200 250 300 350 -50 100 150 200 250 300 IgG(агр), мкг/мл IgG(агр), мкг/мл Рис. 4. Определение иммунных комплексов Рис. 5. Определение иммунных комплексов методом анти-C1q и методом ПЭГ на мо- методом CIC-C1Q на модельных комдельных комплексах, полученных тепловой плексах, полученных тепловой агрегацией агрегацией IgG человека. IgG человека.

Полученные данные можно объяснить тем, что опсонизация комплексов субкомпонентом C1q мешает связыванию с C1q, сорбированным на микропанели. Следовательно, и при определении реальных ЦИК в сыворотке опсонизация комплексов эндогенным C1q может мешать их связыванию на микропанели.

Было проведено сопоставление данных, полученных тремя методами, при определении реальных ЦИК в 31 сыворотке крови обследуемых пациентов. На рис. показано, что данные определения методом ПЭГ и методом анти-C1q обнаруживают по крайней мере два типа ЦИК, проявляющихся по-разному в двух различных методах. Такая же картина наблюдается при сравнении методов ПЭГ и CIC-C1Q (рис. 7).

Отличия ЦИК, дающих различные картины при сравнении метода осаждения ПЭГ с иммуноферментными методами, в основе которых лежит связывание иммунными комплексами C1q, могут состоять в размерах этих иммунных комплексов.

1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0,-0,0,0 50 100 150 -0,ЦИК (метод ПЭГ), у.е.

ЦИК (метод ПЭГ), у.е.

Рис. 6. Определение циркулирующих им- Рис. 7. Определение циркулирующих иммунных комплексов методом анти-C1q и мунных комплексов методом CIC-C1Q и методом ПЭГ в сыворотках крови обсле- методом ПЭГ в сыворотках крови обследуемых пациентов. дуемых пациентов мкг/мл мкг/мл Иммунные комплексы (определение), Иммунные комплексы (определение), ЦИК (метод CIC-C1Q), мкг/мл ЦИК (метод анти-C1q), ед.ОП (450 нм) Более удовлетворительные данные были получены при сравнении близких методов анти-C1q и CIC-C1Q (рис. 8). В последнем случае 7 из 31 точки (около 20%) выпадают из общей тенденции. Кроме того, концентрации ЦИК, полученные методом CIC-C1Q, ниже, чем для метода анти-C1q. О возможных причинах этого говорилось выше.

Одной из положительных особенностей метода анти-C1q является его пригодность для определения не только IgG-содержащих иммунных комплексов, но также и для IgA-ЦИК и IgM-ЦИК, поскольку, как уже было сказано, C1q связывается, кроме IgG, также и с IgM и IgA. Правда, в последнем случае такие иммунные комплексы не способны активировать классический путь комплемента, а только альтернативный.

Для того чтобы метод анти-C1q применить для определения IgA-ЦИК и IgM-ЦИК, достаточно лишь поменять анти-IgG конъюгат, на анти-IgA или анти-IgM.

1,IgA-ЦИК y = 0,2055x + 0,R = 0,1,IgM-ЦИК y = -0,1968x + 0,60 R = 0,y = 1,8848x + 14,R = 0,0,0,0,0,0 10 20 30 0 0,2 0,4 0,6 0,8 CIC C1Q, мкг/мл IgG-ЦИК, ед.ОП (450 нм) Рис. 8. Определение циркулирующих им- Рис. 9. Корреляция содержания IgAмунных комплексов методом CIC-C1Q и ЦИК и IgM-ЦИК с IgG-ЦИК при опреанти-C1q в сыворотках крови обследуе- делении методом анти-C1q в сыворотмых пациентов. ках крови обследуемых пациентов.

На рис. 9 показана корреляция содержания IgA-ЦИК и IgM-ЦИК с IgG-ЦИК при определении методом анти-C1q в сыворотках крови обследуемых пациентов. Интересно отметить, что увеличение содержания IgG-ЦИК приводит также к повышению содержания IgA-ЦИК. Обратная корреляция IgG-ЦИК и IgM-ЦИК объяснима тем обстоятельством, что первоначально иммунный ответ развивается в виде IgM антител, а затем происходит переключение на синтез IgG антител. Поэтому с ростом специфических IgG антител содержание специфических IgM антител должно падать.

Очевидно, что такая тенденция должна проявляться и для иммунных комплексов.

Все изученные методы дают одинаково хорошие результаты при исследовании модельных ЦИК. Однако результаты определения реальных ЦИК в испытуемых сыворотках не вполне совпадают при определении разными методами. Одной из причин этого может быть влияние размеров комплексов на результаты количественных определений ЦИК этими методами. Метод, предлагаемый в данной работе, основан на опанти-C1q, мкг/мл IgA и IgM ЦИК, ед. ОП (450 нм) ределении иммунных комплексов, связанных с C1q. Поскольку связывание C1q может приводить к активации комплемента, то патогенность ЦИК определяется именно этим обстоятельством. В связи с этим, а также с его относительной дешевизной метод можно считать предпочтительным для клинического применения.

Определение содержания C1q-связывающих специфических антител Описанный выше метод определения комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов был применен для обнаружения специфических антител в составе ЦИК, создаваемых путем добавления в тестируемую сыворотку специфического антигена. Этот подход напоминает традиционную реакцию связывания комплемента, в которой гемолитический метод заменен иммуноферментным. Привлекательность такого подхода состоит в том, что, имея одну лишь тест-систему для определения иммунных комплексов, можно было бы определять любые специфические антитела при наличии специфического антигена. Возможность такого подхода была апробирована с использованием вирусных и бактериальных антигенов.

Была исследована зависимость количества IgG в иммунных комплексах (образующихся при добавлении антигена к иммунным сывороткам крови), содержащих C1q и связывающихся на микропанели, покрытой антителами к C1q, от количества иммунных IgG, определяемых в тех же сыворотках с помощью микропанелей со связанным антигеном.

Было найдено, что специфические иммунные комплексы различаются способностью опсонизироваться комплементом. То есть, число специфических иммунных комплексов, опсонизированных C1q, не дает однозначной линейной зависимости от числа иммунных антител, а обнаруживается несколько линейных зависимостей. Такая гетерогенность антител дискретна и ограничена небольшим набором типов, что, повидимому, может быть использовано для характеристики индивидуального иммунного ответа для каждого пациента.

Для определения количества специфических иммунных антител IgG класса были использованы коммерческие или сконструированные собственные ИФА тестсистемы, в которых на микропанели сорбировали антиген, в лунки микропанели добавляли испытуемые сыворотки в подобранном разведении и количество связавшихся иммунных антител определяли с помощью конъюгата антител против IgG человека.

Для определения количества специфических иммунных антител IgG класса, способных формировать комплементсвязывающие иммунные комплексы с исследуемым антигеном, проводили преинкубацию испытуемых сывороток с подобранным количеством антигена. Полученные опсонизированные эндогенным C1q иммунные комплексы связывались на микропанели с сорбированными антителами против C1q человека. Количество специфических иммунных антител в составе иммунных комплексов определяли с помощью конъюгата антител против IgG человека.

Для проверки адекватности определения количества специфических иммунных антител IgG класса вторым методом результаты, полученные им, наносили на график против результатов, полученных первым методом. Полученные графики показаны на рис. 10.

Во всех случаях с иммунными сыворотками против вакцины Кодивак (а), вирусов герпеса I типа (б), кори (в) и цитомегаловируса (г) графики представляли собой набор прямых линий (от двух до четырех), которые свидетельствовали о гетерогенности специфических иммунных антител IgG класса, существующих в разных типах иммунных сывороток. При этом всегда обнаруживалась популяция антител, которая при их низком содержании по данным прямого определения показывала наличие высокого содержания опсонизированных C1q иммунных комплексов, образованных специфическими иммунными антителами. Эту популяцию антител из-за их низкой концентрации мы склонны отнести к «базовым», существующим до развития индуцированного ответа и исчезающим после накопления в более высоких концентрациях «иммунных» антител. Эти данные согласуются с полученными ранее результатами по вакцинации против менингококка: до вакцинации в сыворотках обнаруживались антитела к наиболее сильному эпитопу, а после вакцинации эти антитела исчезали, зато появлялись антитела к слабым эпитопам.

Причина наблюдаемой гетерогенности специфических антител пока не ясна.

Можно лишь предполагать, что в более крупных иммунных комплексах может обнаруживаться предлагаемым методом меньшее количество антител, что обусловлено стерическими препятствиями. Тем не менее, можно говорить о различиях в типе иммунного ответа различных индивидуумов и таких типов ответа существует для данного антигена ограниченное число.

а б г в Рис. 10. Зависимость количества C1q-связывающих специфических иммунных комплексов от количества специфических иммунных антител против вакцины кодивак (а), вирусов герпеса (б), кори (в), цитомегаловируса (г) в сыворотках иммунных больных.

ВЫВОДЫ 1. Разработаны иммуноферментные методы определения констант ингибирования связывания C1q с иммунными комплексами и другими активаторами классического пути. Показана роль электростатических взаимодействий при связывании C1q с активаторами.

2. Определены константы ингибирования связывания C1q некоторыми лекарственными веществами. Предложен механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента.

3. Выявлена способность паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента без участия антител.

4. Разработан иммуноферментный метод количественного определения C1qсвязывающих иммунных комплексов. Метод позволяет адекватно оценивать наличие патогномоничных циркулирующих иммунных комплексов.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»