WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Затем инкубационные смеси вносили в лунки микропанели для ИФА, в которых был сорбирован активатор классического пути – IgG3 или липополисахарид (ЛПС). Связавшийся C1q после инкубации и отмывания лунок от несвязавшегося C1q определяли с помощью конъюгата с пероксидазой хрена кроличьих IgG антител против C1q человека.

В другом подходе ингибитор в различных концентрациях вносили в лунки микропанели, в которых был предварительно сорбирован C1q, в смеси с конъюгатом неспецифического IgG человека с пероксидазой хрена. Во всех случаях определяли максимальное связывание z0 в отсутствие ингибитора и zi – связывание в присутствии ингибитора в концентрации [I]. Константу ингибирования Ki определяли по линейному уравнению 1/ zi = [I]/(z0Ki) + 1/z0], строя график зависимости 1/ zi от [I] (рис. 2).

дисульфофенилантрон Рис. 2. Определение Ki для ингибирования связывания C1q дисульфофенилантроном:

Результаты определения ингибирования связывания C1q разными методами приведены в таблице 1.

Табл. 1. Ингибирование связывания C1q, определенное методами ИФА Ki, мг/мл Ингибитор на C1q на IgG3 на ЛПС гексаметилендиамин 0.185 ± 0.016 0.214 ± 0.017 0.191 ± 0.глутаровая кислота 0.493 ± 0.025 0.534 ± 0.024 0.709 ± 0.Как следует из данных таблицы, наблюдается практическое совпадение констант, определенных разными методами, что свидетельствует об адекватности этих методов.

Новые методы давали также сопоставимые по порядку величин результаты и с разработанными ранее гемолитическими методами (табл. 2). Однако в гемолитическом методе константы ингибирования были ниже, чем определенные методом ИФА.

Причиной этого может быть разное соотношение партнеров связывания (C1q и иммуноглобулинов) в этих двух методах.

Табл. 2. Ингибирование связывания C1q, определенное методом ИФА и гемолитическим методом Гемолитический Ингибитор ИФА метод лизоцим (4.7 0.2)10-4 М (2.9 0.9)10-4 M дисульфат бетулина (42.2 2.6)10-6 М (8.6 1.8)10-6 М сульфат бетулиновой кислоты (57.3 12.2)10-6 М (14.6 3.5)10-6 М Сравнение ингибирующего действия на комплемент в опытах in vitro и in vivo Обнаружение ингибирующего действия вещества на комплемент и определение константы ингибирования этим веществом активации комплемента на стадии связывания C1q в опытах in vitro, является лишь первым этапом на пути создания лекарственных веществ, блокирующих действие комплемента. Важным является знание действия веществ на комплемент на уровне организма. Чтобы изучить влияние вещества in vivo, необходима животная модель. В литературе описана модель (Higgins PJ, 1997), в которой морской свинке внутривенно вводят кроличью иммунную сыворотку, содержащую антитела к эритроцитам морской свинки.

Для сравнения ингибирующего действия на комплемент в опытах in vitro и in vivo мы воспользовались разработанным ранее способом, позволяющим определять ингибирующее действие веществ на комплемент на модельных животных. В качестве модельных животных использовали беспородных мышей, а в качестве источника комплемента и антител к клеткам крови животного сыворотку крови норок, комплемент которой обладает высокой активностью и в которой присутствуют в высоких титрах естественные антитела к эритроцитам мышей. В контрольных группах животным вводили в ретроорбитальное венозное сплетение 0.06-0.08 мл сыворотки крови норки, доведенной до объема 1 мл раствором 0.15 М NаС1. В опытных группах животных в этом растворе дополнительно содержалось 10 мг ингибитора. В одном из опытов 10 мг ингибитора в объеме 0.5 мл вводили за 2 мин до введения сыворотки норки также в общем объеме 0.5 мл. Число погибших животных подсчитывали через сутки. В контрольной группе без ингибиторов наблюдалась 100 % гибель мышей.

Было проведено изучение действия сурамина и гепарина на гибель мышей в результате парентерального введения им сыворотки норки. При этом в опытах одновременно с сывороткой норки мышам вводили соответствующий ингибитор в различных количествах. Введение 10 мг ингибиторов на мышь полностью отменяет гибель животных. Изучение дозозависимости отмены гибели животных под действием ингибиторов показало, что частичная гибель мышей начинает наблюдаться при введении 0.1 мг на мышь гепарина или 1 мг на мышь сурамина. Если учесть общий объем крови мыши 1-2 мл и 1 мл вводимого физиологического раствора, содержащего ингибитор и сыворотку норки, то достигаемые концентрации ингибиторов в условиях частичной гибели животных соответствуют константам ингибирования, полученным в опытах in vitro (для сурамина Ki 411 29 мкг/мл, а для гепарина 36.4 1.7 мкг/мл).

Таким образом, действие гепарина в опытах in vitro и in vivo по сравнению с сурамином в 10 раз сильнее в весовом соотношении. Такая корреляция свидетельствует о том, что в опытах на мышах причиной их гибели является действие комплемента, а ингибирование последнего приводит к выживанию животных.

Роль электростатических взаимодействий при связывании C1q с активаторами Роль ионных взаимодействий между C1q и IgG при связывании хорошо известна. Важно было установить, наличие каких зарядов (положительных или отрицательных) следовало бы ожидать в связывающих центрах молекулы C1q и ее лиганда и наиболее благоприятные расстояния между этими зарядами. Для этого было проведено определение констант ингибирования связывания C1q с его активаторами для ряда гомологичных диаминов и дикарбоновых кислот.

Ингибирование связывания C1q с IgG3 диаминами и дикарбоновыми кислотами изучали методом ИФА с сорбированным IgG3 человека в лунках микропанели и сывороткой крови в качестве источника C1q. Результаты показаны в табл.3 и на рис.3.

Табл. 3. Константы ингибирования диаминами и дикарбоновыми кислотами связывания C1q с сорбированным на микропанели IgG3.

Расстояние между заряженИнгибитор Ki, мМ ными группами, нм 1,3-Диаминопропан 0.49 59.30 ± 5.1,4-Диаминобутан 0.59 17.70 ± 2.1,5-Диаминопентан 0.75 8.33 ± 0.1,6-Диаминогексан 0.87 1.06 ± 0.1,7-Диаминогептан 1.00 1.76 ± 0.1,10-Диаминодекан 1.39 1.26 ± 0.Малоновая кислота 0.44 8.73 ± 2.Янтарная кислота 0.51 0.66 ± 0.Глутаровая кислота 0.66 0.49 ± 0.Адипиновая кислота 0.71 1.15 ± 0.Пимелиновая кислота 0.89 3.01 ± 0.Пробковая кислота 0.94 3.71 ± 0.Рис. 3. Зависимость констант ингибирования взаимодействия C1q с иммуноглобулином G3 от расстояния заряженных групп в ингибиторах.

Полученные результаты показали, что как для диаминов, так и для дикарбоновых кислот существуют расстояния между заряженными группами, обеспечивающие наилучшее ингибирование связывания. Это 0.87 нм для диаминов и 0.66 нм для дикарбоновых кислот. Можно предположить, что ингибитор, блокируя взаимодействие двух партнеров связывания, имитирует какой-либо один из них. Мы провели измерения констант ингибирования связывания C1q с активатором, используя различные активаторы классического пути и преинкубацию ингибитора с различными партнерами такого взаимодействия без отмывки ингибитора после инкубации и с отмывкой. Результаты исследования приведены в таблице 4.

Табл. 4. Константы ингибирования гексаметилендиамина и глутаровой кислоты в зависимости от способа определения.

Гексаметилендиамин Глутаровая кислота Способ измерения Отношение Отношение Ki, мг/мл R2 Ki, мг/мл Rконстант констант На C1q 0.184 ± 0.016 0.99 0.493 ± 0.0249 0.2.2 4.На C1q с отмывкой 0.413 ± 0.075 0.91 2.19 ± 0.38 0.На IgG3 0.214 ± 0.017 0.98 0.534 ± 0.024 0.5.0 На IgG3 с отмывкой 1.07 ± 0.13 0.96 19.2 ± 1.0 0.На ЛПС 0.191 ± 0.022 0.98 0.709 ± 0.038 0.1.9 9.На ЛПС с отмывкой 0.353 ± 0.101 0.86 6.97 ± 0.07 0.0.На ЦМВ 0.733 ± 0.010 3.21 ± 0.10 0.2.4 - 0.На ЦМВ с отмывкой 1.79 ± 0.087 - - В таблице приведены результаты экспериментов по определению констант ингибирования для гексаметилендиамина и глутаровой кислоты. В первых двух строках в иммуноферментном методе анализа на C1q, сорбированном на микропанели, показано связывание конъюгата IgG человека с пероксидазой хрена в присутствии ингибитора и после отмывки преинкубированного в лунках планшета ингибитора. Во вторых двух строках представлено связывание C1q с сорбированным на микропанели IgG3 человека. Связавшийся C1q определяли с помощью конъюгата кроличьих антител против C1q с пероксидазой хрена. Точно также определяли связывание с ЛПС и цитомегаловирусом (ЦМВ), сорбированными на микропанели. Эти данные подтвердили способность C1q связываться с ЛПС и ЦМВ антителонезависимым способом.

Как следует из данных таблицы по отношению констант, при отмывке преинкубированного гексаметилендиамина, последний лучше связывается с C1q, ЛПС и ЦМВ, по сравнению с IgG3. В случае ЛПС гексаметилендиамин, по-видимому, блокирует две фосфатные группировки липида А, необходимые для связывания с C1q, как это происходит при блокировании этим диамином связывания липида А с рецептором ЛПС по данным литературы. Для ЦМВ ответственной за связывание с C1q, повидимому, является ДНК вируса, при этом связывание с вирусом глутаровой кислоты маловероятно. Это позволяет предполагать наличие в связывающем центре C1q как положительно заряженных групп (ответственных за связывание с ЛПС и ЦМВ), так и отрицательно заряженных (существенных для связывания с иммуноглобулинами).

Глутаровая кислота задерживается после отмывки лучше всего на C1q, что характеризует наличие положительно заряженных групп в связывающем центре C1q и, возможно, моделирует отрицательно заряженные группы в комплементсвязывающем участке иммуноглобулина. Данные о преимущественном связывании глутаровой кислоты с C1q коррелируют с полученными ранее в нашей группе результатами по ингибированию полиметакриловой кислотой гемолитической активности комплемента вследствие преимущественного связывания с C1q.

Исследование действия лекарственных веществ на комплемент Лекарственные вещества могут оказывать действие на систему комплемента (Козлов Л.В., 2007). Исследованию способности ингибировать классический путь активации комплемента подвергли разнообразный набор лекарственных веществ, включающий нестероидные противовоспалительные препараты, вещество растительного происхождения, антибиотик, дезинфицирующие, антилепрозное, антималярийное и антипротозойное средства. Результаты приведены в таблице 5.

Табл. 5. Константы ингибирования связывания комплемента лекарственными веществами.

Максимальная Ki C1q, Необходимая суточная тераЛекарство мкг/мл доза, мг певтическая доза, мг сульфетрон 0.06 ± 0.01 0.3 мирамистин 0.10 ± 0.03 0.5 деринат 4.45 ± 0.19 20 куркумин 5.29 ± 0.17 27 лизоцим 6.71 ± 1.76 35 диклофенак 19.0 ± 2.9 95 слабилен 25.5 ± 1.64 128 гепарин 36.4 ± 1.7 180 мелоксикам 116 ± 18 580 кромогликат 349 ± 33 1750 сурамин 411 ± 29 2055 делагил 544 ± 178 2720 гентамицин 47200 ± 3100 236000 Для того чтобы можно было сравнить ингибирующее действие веществ по их эффективности, в таблице приведены максимальные терапевтические дозы этих лекарственных соединений и необходимая доза принимаемого препарата для достижения эффекта половинного ингибирования комплемента, рассчитанная из концентрации в крови, равной константе ингибирования, и общего объема крови 5 л. Конечно, такой расчет не всегда правилен. Для исследованных веществ его нельзя применять для мирамистина (препарата наружного применения) и проблематично для кромогликата натрия (ингаляционного препарата). Тем не менее, можно было бы ожидать, что в случаях, когда необходимая доза ниже максимальной терапевтической, должно наблюдаться подавление функциональной активности комплемента на стадии его активации. Если исключить из рассмотрения уже упомянутые мирамистин и кромогликат натрия, то выпадают из потенциально активных гентамицин, сурамин, мелоксикам, диклофенак и делагил. Гентамицин существенно различается по необходимой и максимальной дозам. Что касается мелоксикама, делагила и диклофенака, как известно обладающих противовоспалительным действием, то следует отметить, во-первых, интересующие нас необходимая и максимальная дозы для диклофенака и делагила в принципе сопоставимы, а во-вторых, можно предполагать, что эти соединения, как и большинство нестероидных противовоспалительных препаратов, активны на другой стадии активации комплемента и блокируют образование C3/C5-конвертаз. Описанные в литературе константы половинного подавления гемолитической реакции для классического пути комплемента для слабилена, сульфетрона и куркумина практически совпадают с нашими данными по определению константы ингибирования первой стадии процесса активации комплемента.

Предложенный метод определения действия лекарственных веществ на систему комплемента на первой стадии процесса активации позволяет обнаружить и оценить эффективность исследуемых веществ в их воздействии на комплемент.

Метод полезно использовать для поиска препаратов, обладающих способностью ингибировать комплемент, а также для изучения побочного действия лекарственных веществ.

Антителонезависимая активация комплемента антигенами гельминтов Гельминтозы сопровождаются гуморальным иммунным ответом, что объясняется возможным контактом паразитов или их антигенов с кровью или слизистой хозяина. Важным критерием развития иммунного ответа является способность комплемента опсонизировать антиген, узнавая его антителонезависимым способом. Система комплемента антителонезависимо активируется: 1) классическим путем при прямом связывании компонента C1q с активатором без посредства антител; 2) альтернативным путем, если активатор способен связывать на себе активированный компонент C3.

Исследована способность секреторно-экскреторных антигенов Trichinella sp., Оpisthorchis felineus, Toxocara sp., Echinococcus sp. активировать систему комплемента антителонезависимым способом по двум из перечисленных выше путей. Для этого были использованы полистироловые планшеты, содержащие сорбированные секреторно-экскреторные антигены трихинелл, описторхисов, токсокар, эхинококков, производства «Вектор-Бест» и нормальная человеческая сыворотка, не содержащая антител ни к одному из указанных гельминтов. Для изучения связывания комплемента и его активации в лунках планшетов с антигенами инкубировали сыворотку крови человека в условиях активации классического пути комплемента (с ионами Ca2+ и Mg2+) и альтернативного пути (с ионами Mg2+ в отсутствие ионов Ca2+). После инкубации с помощью конъюгатов соответствующих антител с пероксидазой определяли связывание на сорбированных антигенах компонентов C1q и C3. Связывание C1q свидетельствовало об антителонезависимом узнавании антигена классическим путем активации комплемента, а связывание компонента C3 – об активации классического или альтернативного путей.

Полученные данные приведены в таблице 6.

Табл. 6. Определение активации альтернативного и классического путей комплемента на поверхностных антигенах гельминтов.

Альтернативный Антигены Классический путь путь гельминтов Связывание C3, у.е. Связывание C3, у.е. Связывание C1q, у.е.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»