WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

БИЧУЧЕР Анна Мироновна СВЯЗЫВАНИЕ C1Q – ИНГИБИРОВАНИЕ, АКТИВАЦИЯ КОМПЛЕМЕНТА, ОПСОНИЗАЦИЯ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ 14.00.36 – аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Козлов Леонид Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ляшенко Всеволод Андреевич доктор биологических наук, профессор Мягкова Марина Александровна

Ведущая организация: Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России

Защита диссертации состоится «»_2008 г. в часов на заседании специализированного совета Д 208.046.02 ФГУН «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ по адресу: 125212 Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ.

Автореферат разослан «» 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Комплемент является передовым и неспецифическим барьером в защите организма от внешней агрессии и внутренних нарушений. Важным звеном в запуске каскада активации наиболее мощного классического пути комплемента является узнавание первым компонентом комплемента – его C1q субкомпонентом – активаторов:

иммунных комплексов в антителозависимом ответе и в антителонезависимом ответе некоторых структур, являющихся индикаторами патологического процесса.

Поскольку каскад активации комплемента в конечном итоге приводит к уничтожению клеток, опознанных агрессивными или патологическими, и развитию реакций воспаления, становится понятным желание регулировать действие комплемента, особенно в тех случаях, когда по ряду терапевтических соображений процесс, определенный комплементом как патологический, оказывается для организма полезным.

Явлениями с участием комплемента, которые необходимо отменить, являются, например, отторжение трансплантата или воспаление при аутоиммунных заболеваниях (Roos A., Daha M.R., 2002).

Циркулирующие в кровотоке иммунные комплексы как результат проявления иммунной защиты или аутоиммунной агрессии являются индикатором иммунного процесса, а также частью патологического звена. Свои функции иммунные комплексы проявляют при воздействии на комплемент, а именно при узнавании их субкомпонентом C1q (Schumaker V.N., 1986). Поэтому мерилом патогенности циркулирующих иммунных комплексов является их опсонизация C1q.

Защита комплементом от инфекций и инвазий может начинаться даже при отсутствии в организме антител к агрессору. В этом случае определенные поверхностные структуры последнего могут опознаваться непосредственно C1q или участниками альтернативного пути (Haeney M.R., 1998, Nauta A.J. et al., 2002). Необходимо понимание роли антителонезависимой защиты от различных возбудителей инфекции и инвазии.

Одним из важных способов контроля функционирования комплемента является блокирование активации его классического пути (Roos A. et al., 2001). Такое блокирование достигается ингибированием реакции связывания C1q с активатором комплемента, в частности с иммунными комплексами. Поскольку на сегодняшний день известны многие соединения, способные в той или иной степени ингибировать связывание комплемента, целесообразно при создании лекарственных веществ - ингибиторов комплемента осуществлять поиск ингибиторов среди уже имеющихся препаратов, разрешенных к применению.

Все изложенное выше свидетельствует о необходимости создания методов для изучения реакции связывания C1q с активатором, ингибирования этого связывания и блокирования патологических процессов, в которых участвует C1q. Поэтому исследование: «Связывание C1q – ингибирование, активация комплемента, опсонизация иммунных комплексов» является актуальным.

Цель настоящего исследования Создание методов и изучение с их помощью связывания C1q с активаторами классического пути системы комплемента, ингибирования этого связывания и блокирования патологических процессов, в которых участвует C1q.

Задачи исследования 1. Разработать иммуноферментные методы определения ингибирования связывания C1q с активаторами классического пути системы комплемента. Сравнить результаты определения констант ингибирования, вычисленных с помощью иммуноферментных методов, с данными, полученными гемолитическим методом и в опытах на модельных животных.

2. Исследовать механизм связывания C1q с IgG на соединениях, имитирующих обоих участников реакции.

3. Определить константы ингибирования связывания C1q некоторыми лекарственными веществами с целью обнаружения потенциальных регуляторов системы комплемента.

4. Изучить способность бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента антителонезависимым путем.

5. Разработать иммуноферментный метод количественного определения C1qсвязывающих иммунных комплексов и сравнить его с другими методами определения ЦИК на реальном материале.

6. Разработать иммуноферментный метод определения антител, способных образовывать с антигенами иммунные комплексы, связывающие комплемент.

Научная новизна 1. Впервые разработан иммуноферментный метод определения ингибирования связывания C1q с активаторами классического пути системы комплемента. Метод применен для изучения механизма связывания C1q с IgG. Показана роль ионных взаимодействий.

2. Определение констант ингибирования связывания C1q некоторыми лекарственными веществами выявило механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента.

3. Разработан экономичный иммуноферментный метод количественного определения C1q-связывающих иммунных комплексов.

4. Установлена способность бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента антителонезависимым путем.

5. Полученные результаты позволили углубить знания о природе взаимодействия С1q со своими мишенями и о взаимосвязи между структурой веществ и их ингибирующей активностью.

6. Впервые разработан иммуноферментный метод определения C1q-связывающих специфических антител.

Практическая значимость Иммуноферментный метод количественного определения C1q-связывающих иммунных комплексов с использованием поликлональных антител позволяет адекватно оценивать наличие патогномоничных циркулирующих иммунных комплексов. Разработанный метод пригоден для использования в практической медицине для диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний.

Созданная методика определения констант ингибирования связывания C1q позволяет проводить поиск ингибиторов C1q среди лекарственных и нелекарственных веществ.

Практическая ценность работы подтверждена двумя патентами.

Положения, выносимые на защиту Разработаны иммуноферментные методы определения констант ингибирования связывания C1q с иммунными комплексами и другими активаторами классического пути. Определение констант ингибирования связывания C1q некоторыми лекарственными веществами позволило выявить механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента, и позволило предложить метод поиска потенциальных регуляторов системы комплемента.

Иммуноферментные методы количественного определения C1q-связывающих иммунных комплексов и определения C1q-связывающих специфических антител могут использоваться для оценки клинической роли специфических антител и их иммунных комплексов.

Апробация работы Апробация проведена на заседании секции «Общая и прикладная иммунология» Ученого Совета ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ 23 июня 2008 года, протокол № 4. Материалы диссертации были доложены на международной конференции «Цитокины, воспаление, иммунитет» (СанктПетербург, июнь 2002), международной конференции, посвященной 80-летию института им. Л.Пастера (С.-Петербург, 2003), научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (Москва, 2003), III Международном симпозиуме «All About Intravenous Immunoglobulin Therapy (IVIG)» (Плевна, Болгария, 2005), Х Европейском конгрессе «Complement in Health and Disease» (Хайдельберг, Германия, 2005), IV конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005), IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007).

Публикации По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 262 источника, в том числе 27 на русском языке. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 8 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования В работе были использованы сыворотки крови пациентов КДЦ ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ и нормальная донорская сыворотка (ГВКГ им. Н.Н. Бурденко), кроличья сыворотка с поликлональными моноспецифическими антителами к С1q субкомпоненту комплемента человека, препарат С1q собственного изготовления, пероксидазные конъюгаты анти-С1q, анти-С3, антиIgG, белка А собственного изготовления, сыворотка крови норок стандартной коричневой породы (зверосовхоз «Салтыковский»), эритроциты барана, антигены герпеса I типа, кори, цитомегаловируса, субклеточная дифтерийная вакцина Кодивак, пероксидаза хрена, алифатические диамины и дикарбоновые кислоты, ряд лекарственных веществ из аптечной сети.

Для выполнения исследований применялись следующие коммерческие наборы:

набор для микроанализа циркулирующих иммунных комплексов с помощью осаждения полиэтиленгликолем (Набор реагентов для определения циркулирующих иммунных комплексов "Микроанализ ЦИК", ООО "НПО СИНТЭКО, Россия), тест-набор CIC-C1Q ELISA (Bhlmann Laboratories AG, Швейцария) для определения иммунных комплексов.

В работе использованы разработанные иммуноферментные методы определения константы ингибирования связывания C1q с активаторами, метод количественного определения комплементсвязывающих иммунных комплексов.

Иммуноферментный анализ проводился в микропанелях для иммунологических реакций с использованием автоматического ридера «Multiskan EX» (ThermoLabsystems).

В ходе работы были использованы компьютерные программы по вычислению:

средних значений, среднестатистического отклонения, линейной регрессии (Microsoft Office), константы ингибирования Ki, количества белка по диаметру кольца преципитации (Л.В. Козлов).

Ряд разделов работы выполнен с участием соавторов: В.Л. Дьякова (выделение IgG3), З.П. Белкина (эксперименты на мышах), С.В. Буреевой (синтез некоторых ингибиторов C1q), Т.А. Мамаевой (определение антител к вирусу кори), Е.А. Шмелевой и Ю.А. Парамоновой (определение антител к Кодиваку), Л.И. Новиковой (определение антител к герпесу I типа), Г.В. Бобылевой (определение антител к цитомегаловирусу).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Иммуноферментные методы определения ингибирования связывания C1q с активаторами классического пути системы комплемента Определение функциональной активности C1q Для определения функциональной активности субкомпонента C1q первого компонента комплемента была использована способность функционально активного C1q связываться с активаторами классического пути комплемента. Способ, в котором в качестве активаторов были использованы иммуноглобулины G и M человека, сорбированные на микропанели для иммуноферментного анализа, был разработан ранее и на него был получен патент. Количество связавшегося функционально активного C1q определяли с помощью конъюгата с пероксидазой хрена IgG антител против C1q человека.

Мы также показали, что и другие активаторы классического пути комплемента, например, липополисахариды (пирогенал), цитомегаловирус, могут быть использованы для иммуноферментного определения функциональной активности субкомпонента C1q.

При использовании в качестве активатора миеломного моноклонального IgG3, который, как известно, лучше других IgG связывается с C1q, было проведено сравнение метода ИФА с количественным определением C1q методом радиальной иммунодиффузии с использованием стандартной сыворотки с известным содержанием С1q (РИД) и гемолитическим методом определения функциональной активности C1q в сыворотках пациентов. Результаты приведены на рис. 1.

Рис. 1. Сравнение иммуноферментного метода определения функционально активного C1q с гемолитическим методом определения активности и метода радиальной иммунодиффузии определения количества C1q Данные, полученные методом ИФА, вполне сопоставимы с результатами определения количества С1q методом РИД и функциональной активности гемолитическим методом.

Разработка иммуноферментных методов определения ингибирования связывания C1q Для определения способности веществ взаимодействовать с субкомпонентом C1q комплемента известен способ, основанный на ингибировании связывания C1q с сенсибилизированными эритроцитами барана, т.е. ингибировании инициации каскада активации комплемента, завершающегося лизисом эритроцитов. Гемолитический метод, используемый в этом способе, не отличается высокой степенью воспроизводимости и связан с необходимостью приготовления гемолитической системы на основе эритроцитов барана. Кроме того, метод требует удаления из системы исследуемого ингибитора после стадии связывания C1q с антителами, поскольку нельзя исключить возможности действия ингибитора на поздних этапах каскада активации, что усложняет процесс определения ингибирующего действия.

Для изучения ингибирования связывания C1q с активаторами классического пути было предложено два подхода, основанных на использовании иммуноферментного метода анализа. В первом случае предварительно инкубировали смесь ингибитора в различных концентрациях с раствором чистого C1q в одной определенной концентрации или с сывороткой крови, содержащей C1q, в подобранном разведении.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»