WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

БАБАЕВ АЛЕКСЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ РАСТВОРИМЫЕ КОМПЛЕКСЫ АНТИГЕНОВ АДГЕЗИИ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА 14.00.36 – аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 Нижний Новгород 2006

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» и Федеральном государственном учреждении науки «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им.

акад. И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор В.В. Новиков

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, доцент Евсегнеева Ирина Валентиновна Доктор биологических наук, профессор Козлов Леонид Васильевич

Ведущая организация:

Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им.

Н.Н. Блохина РАМН

Защита состоится «»_2006 года в «» часов на заседании диссертационного совета К 208.046.01 при ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора 3 Автореферат разослан «_»2006 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат медицинских наук Л.И. Новикова 4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Белки адгезии играют важную роль во многих биологических процессах, таких как эмбриогенез, гемостаз и воспаление. Основная их функция состоит в поддержании межклеточных взаимодействий и взаимодействий между клетками и экстраклеточным матриксом. Подобные контакты обеспечивают передачу сигналов, регулирующих функции структурных компонентов цитоскелета, участвующих в процессе активации клетки. Благодаря своим цитоплазматическим доменам адгезивные молекулы воспринимают внутриклеточные сигналы, которые регулируют экспрессию, распределение по клеточной мембране (спрейдинг) и функциональную активность поверхностных рецепторов (Aplin et al., 1998). К антигенам адгезии относят большую группу интегринов, являющихся гетеродимерами. Наиболее важную роль в иммунных реакциях играет семейство 2-интегринов и иммуноглобулиноподобные белки семейства ICAM. Так, в формировании иммунологического синапса участвуют 2-интегрин, называемый LFA-1, и белок адгезии ICAM-1 (Bromley et al., 2001). В инициации первичного иммунного ответа принимает участие антиген адгезии ICAM-3, взаимодействующий на дендритных клетках с DC-SIGN, а также с LFA-(CD11a/CD18) (van der Vieren et al., 1995; Bleijs et al., 2001).

Многие молекулы адгезии существуют не только в мембранной, но и в растворимой форме. Растворимые антигены адгезии могут находиться как в мономерной, так и в олигомерной форме, они сохраняют способность взаимодействовать со своими мембранными партнерами, принимают участие в регуляции иммунных реакций (Новиков и др., 2006; Jun et al., 2001). Их содержание в биологических жидкостях способно меняться при вирусных гепатитах, ВИЧ-инфекции, ожоговой патологии, аутоиммунных и онкологических заболеваниях (Евсегнеева и др., 2005; Horiike et al., 1994; Blann et al., 2002). Концентрация растворимых молекул адгезии в сыворотке крови может выступать как показатель тяжести течения и прогноза некоторых заболеваний (Лебедев, 2003; Kuang et al., 2002).

Цель исследования На основе существующих предпосылок изучить возможность наличия в крови человека растворимых комплексов, состоящих из 2-интегринов и молекул адгезии семейства ICAM, и оценить влияние патологических состояний на их сывороточный уровень.

Задачи 1. Оценить сывороточный уровень растворимого CD50 антигена при вирусных гепатитах А, В, С, ожоговой травме, раке молочной железы.

2. Определить относительное содержание в сыворотке крови суммарной и олигомерной фракций растворимого CD54 антигена при указанных заболеваниях.

3. Разработать иммуноферментный метод детекции растворимой формы CD18 антигена.

4. Определить сывороточный уровень растворимой формы CDантигена в крови здоровых доноров и больных вирусными гепатитами, раком молочной железы, ожоговых больных.

5. Разработать иммуноферментные методы детекции растворимых комплексов CD18-СD54 и CD18-CD50 в крови человека и определить их сывороточное содержание у здоровых доноров.

6. Оценить сывороточный уровень растворимых ассоциатов CD18-СDи CD18-CD50 при вирусных гепатитах А, В, С, ожоговой травме, раке молочной железы.

Научная новизна Выявлены изменения сывороточного уровня растворимого CD50 (sCD50) антигена, а также относительного содержания CD50-положительных (CD50+) мононуклеарных клеток у больных с ожоговой травмой различной площади поверхности тела на протяжении всего периода течения ожоговой болезни.

Показано повышение сывороточного уровня суммарной фракции растворимого CD54 (sCD54) антигена у больных вирусным гепатитом С, не имеющих антител к NS3 или NS4 белкам или имеющих IgМ к core-антигену.

При вирусных гепатитах А и С, ожоговой болезни обнаружено увеличение сывороточного уровня олигомерной фракции sCD54 антигена.

Продемонстрировано наличие растворимой формы CD18 (sCD18) антигена в крови человека. Сывороточный уровень sCD18 антигена увеличивался при вирусном гепатите А, снижался при раке молочной железы. Выявлены изменения в сывороточном уровне sCD18 антигена, а также в относительном содержании CD18-положительных (CD18+) мононуклеарных клеток периферической крови, сохранявшиеся на протяжении всего периода ожоговой болезни.

В крови человека впервые обнаружены растворимые ассоциаты антигенов CD18 и CD54, а также антигенов CD18 и CD50. Определена их сывороточная концентрация в крови здоровых доноров. У больных вирусным гепатитом В с высоким титром НВs-антигена наблюдалось снижение уровня растворимых комплексов CD18-CD54, а с более низким титром НВs-антигена – повышение сывороточного содержания растворимых комплексов CD18-CD50. Показано, что концентрация комплексов CD18-CD54 возрастала в крови больных вирусным гепатитом С, не имеющих антител к NS3 или NS5 антигенам. У больных гепатитом С, в крови которых были выявлены IgМ к core-белку, повышался сывороточный уровень растворимых комплексов CD18-CD54 и CD18-CD50. При раке молочной железы содержание растворимых комплексов CD18-CD54 снижалось.

Практическая значимость работы С использованием моноклональных и поликлональных антител разработаны иммуноферментные методы определения растворимого антигена CD18, а также растворимых комплексов CD18-CD54 и CD18-CD50 в сыворотке крови. Методы применимы при изучении участия этих белков в молекулярных механизмах иммунных реакций. Результаты могут быть использованы для оценки состояния иммунитета, являться основой для разработки современных методов мониторинга иммуноопосредованных заболеваний, создания новых подходов к оценке эффективности вакцинопрофилактики социально значимых инфекций. Данные включены в программу курса по иммунологии для студентов ВУЗов медицинского и биологического профиля.

Положения, выносимые на защиту 1. В крови человека присутствуют растворимая форма CD18 антигена и растворимые комплексы CD18-CD54 и CD18-CD50.

2. Сывороточный уровень олигомерного sCD54 антигена увеличивается при вирусных гепатитах А и С; концентрация sCD18 антигена повышается при гепатите А и снижается при раке молочной железы. Содержание растворимых ассоциатов CD18-CD54 увеличивается при гепатите С и снижается при раке молочной железы.

3. Выявлены изменения сывороточного содержания sCD18, sCDантигенов, а также относительного количества CD18+ и CD50+ мононуклеарных клеток крови при ожоговой болезни.

Апробация работы Апробация диссертации состоялась 14 сентября 2006 года на расширенном совместном заседании кафедры молекулярной биологии и иммунологии Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского и Нижегородского отделения Российского научного общества иммунологов с участием сотрудников НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной.

Результаты работы представлены на Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2003), VIII, IX и XI Нижегородских сессиях молодых ученых (Нижний Новгород, 2003, 2004, 2006), 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тестметоды химического анализа» (Саратов, 2004), научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной (Нижний Новгород, 2006).

Публикации По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа в объеме 162 листов состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.

Диссертация иллюстрирована 42 рисунками и 9 таблицами. Библиографический указатель включает 203 источника литературы (35 отечественных и иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Материалом для исследования содержания растворимых форм мембранных антигенов служили 65 образцов сыворотки крови больных гепатитом А, образцов сыворотки крови больных острым гепатитом В и 70 образцов сыворотки крови больных острым гепатитом С, находившихся на лечении в Нижегородской городской инфекционной больнице № 2. Также было проанализировано 60 образцов сыворотки крови больных раком молочной железы II-III стадии, проходивших лечение в Нижегородской областной клинической больнице им. Н.А. Семашко. В работе также использовано образцов сыворотки крови пациентов с ожоговой травмой различной степени тяжести, проходивших лечение в Российском ожоговом центре на базе Нижегородского НИИ травматологии и ортопедии. Все диагнозы были поставлены и верифицированы врачебными коллективами соответствующих учреждений.

В качестве контроля использовали образцы сыворотки крови 320 доноров, не содержащие антител к вирусу гепатита С, HBs антиген, антител класса M к цитомегаловирусу и антител классов G и M к возбудителю сифилиса, предоставленные Нижегородской областной станцией переливания крови.

Определение уровня растворимых форм мембранных антигенов проводили двухсайтовым иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител (МКА) серии ИКО и поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток крови человека.

Сывороточный уровень растворимых антигенов CD50, CD54, CD18 определяли с применением меченых пероксидазой хрена МКА ИКО-60, ИКО-184, ИКО108, соответственно, и поликлональных антител против мононуклеарных клеток периферической крови человека, используемых в качестве «первых» антител и сорбируемых в лунки планшетов для иммуноферментного анализа.

Для исследования уровня олигомерной фракции растворимого CD54 антигена в качестве первых антител использовали очищенные МКА ИКО-184, в качестве вторых антител применяли МКА ИКО-184, меченные пероксидазой хрена.

Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови проводили методом непрямой иммунофлуоресценции с помощью МКА серии ИКО. Использовали МКА, полученные в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН.

Маркеры вирусных гепатитов определяли с помощью иммуноферментных тест-систем фирмы «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород).

Статистический анализ проводили с использованием критериев МаннаУитни, Стьюдента и критерия ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и их обсуждение В реализации иммунного ответа существенное значение имеют антигены адгезии, обеспечивающие взаимодействия клеток, удерживающие клетки при реализации эффекторных механизмов, принимающие участие в формировании иммунного синапса. Одним из результатов взаимодействия клеток служит появление в крови растворимых антигенов адгезии, образующихся путем протеолитического шеддинга (Новиков и др., 2006).

Предпосылкой к выполнению настоящей работы явилось предположение, что в результате шеддинга молекул адгезии могут образовываться не только растворимые антигены, присутствующие в крови в виде отдельных белковых молекул, но и растворимые комплексы, состоящие из взаимодействующих белков, срезанных с поверхности контактирующих клеток.

Белки, входящие в состав растворимых ассоциатов, лишены способности обеспечивать модулирующие эффекты, свойственные свободным растворимым формам мембранных антигенов. Их центры связывания взаимно блокированы, что приводит к изменению общего иммуномодулирующего потенциала пула растворимых антигенов. В связи с этим эффекторные свойства растворимых форм мембранных антигенов могут непосредственно зависеть от того, находятся они в свободной или связанной форме, то есть в составе растворимого комплекса.

В качестве объектов исследования были выбраны растворимые антигены адгезии - представители суперсемейств иммуноглобулинов - CD50 (ICAM-3), CD54 (ICAM-1) и суперсемейства интегринов (CD18). Их мембранные формы участвуют в формировании иммунологического синапса и тем самым обеспечивают одно из центральных событий иммунного ответа - презентацию антигена. Мы оценили сывороточные уровни растворимых форм этих антигенов при заболеваниях различного генеза - инфекционных (вирусные гепатиты А, В, С), неопластических (рак молочной железы) и травматологических (ожоговая травма).

Сывороточное содержание sCD50 антигена в крови больных вирусным гепатитом А было повышено в 3,7 раза в сравнении с нормой (р<0,05) (рис. 1).

Высокий сывороточный уровень sCD50 антигена у больных вирусным гепатитом А наряду с выявленным ранее высоким содержанием растворимых молекул HLA I класса (Евсегнеева и др., 2005) отражает активное привлечение клеточного звена иммунитета для защиты организма.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»