WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Характеристика функциональности BR в кристаллах. Сравнение спектров поглощения пурпурных мембран (ПМ) и кристалла BR в видимом диапазоне показало, что они одинаковы. Более того, разностные ИК спектры BR адаптированного к темноте по отношению к адаптированному к свету также одинаковы для ПМ и кристалла. Отсюда следует, что кристаллическая упаковка не изменяет способности ретиналя к термической изомеризации в BR, также как и структурные изменения, сопровождающие ее. Как спектр поглощения, так и термическая изомеризация чувствительны к непосредственному окружению ретиналя, поэтому данные наблюдение указывает на то, что структура активного центра BR одинакова в кристалле и ПМ.

Исследование функциональности BR в кристаллах уже проводилось с помощью ИКФурье спектроскопии с миллисекундным временным разрешением и спектроскопии комбинационного рассеяния. Однако, условия экспериментов не позволили выполнить сравнение кинетики фотоцикла в кристалле с фотоциклом в ПМ. Кроме того, информация о микросекундной части фотоцикла в кристалле, включающей К, L и М состояния, полностью отсутствовала.

В данной работе были впервые проведены спектроскопические эксперименты на кристаллах BR в видимом и ИК диапазонах с микросекундным временным разрешением.

В результате показано, что кинетика фотоцикла в ПМ и кристалле различается. В кристалле время жизни L состояния в 1.раза меньше, а М состояния в ~3 раза больше, чем в ПМ. Кроме того, в кристалле не наблюдается временное накопление О состояния в течение фотоцикла (см. рис.6).

Для детального сравнения структурных изменений, соответствующих промежуточным состояниям в ПМ и кристалле была использована ИК-Фурье спектроскопия с Рис.6. Зависимость фотоиндуцированного изменения поглощения от времени на 415, 575 и 655нм для микросекундным временным разрешением.

ПМ (пунктир) и кристалла (сплошная линия).

Спектры промежуточных состояний, полученные с помощью глобального экспоненциального анализа и последовательной однонаправленной модели фотоцикла без разветвлений, показаны на рис. 7. Спектры L и М состояний (рис. 7.а,б) одинаковы для ПМ и кристалла. Исключение составляет небольшой сдвиг частоты валентного колебания карбоксильной группы Асп-85, которая в кристалле на 2 см-1 ниже, чем в ПМ. Спектры, описывающие миллисекундную часть фотоцикла, существенно отличаются (рис.7.в). В ПМ данный временной интервал фотоцикла характеризуется накоплением О состояния, тогда как в кристалле - N состояния.

Из инфракрасных спектров можно заключить, что как и в ПМ, в кристалле, формирование М состояния характеризуется депротонированием шиффова основания (ШО) и протонированием Асп-85.

При переходе из М в N состояние ШО репротонируется и Асп-депротонируется, откуда следует, что ШО репротонируется со Рис.7. Разностные ИК спектры промежуточных состояний стороны ЦП канала. Отсюда можно BR при 20оС. Пунктиром показаны спектры ПМ, временные константы которых (1/2): 60мкс (а), 2.1мс (б) и 11мс (в). заключить, что BR в кристалле Сплошной линией - спектры кристалла с 1/2: 21мкс(а), 3.8мс осуществляет направленный транс(б) и 76мс (в).

порт протонов.

Низкотемпературные промежуточные состояния. В качестве исходной точки для фиксирования промежуточных состояний в кристалле были использованы методы получения стабильных низкотемпературных состояний, оптимизированные для ПМ [9].

Показано, что данные методы могут быть использованы без модификаций для фиксирования К и М состояний в кристалле. Процедуры фиксации L и N состояний были модифицированы. Показано, что стабильное L состояние, без примеси М, в кристалле может быть получено при температурах, не превышающих 155оК, тогда как в ПМ - 170оК.

Данное отличие, вероятно, возникает, как следствие уменьшенного в кристалле потенциального барьера для протонирования Асп-85, как следует из различия в кинетике распада L состояния в кристалле (рис.6.а). Накопление N состояния в ПМ осуществляется при высоких значениях pH. Однако, повышение pH в кристаллах невозможно без ухудшения дифракционного качества. Поэтому, для фиксирования N состояния оптимальной является процедура быстрого замораживания кристалла при постоянном интенсивном освещении. Поскольку в кристалле N состояние долгоживущее, при постоянном освещении оно присутствует в достаточно высоких концентрациях. Поэтому быстрое замораживание позволяет получить ~30% N состояния с примесью 30-40% М.

Исследование низкотемпературных промежуточных состояний с помощью ИК спектроскопии показало, что разностные спектры промежуточных состояний одинаковы в ПМ и кристалле. Исключение, как и в случае ИК спектроскопии с временным разрешением составила частота валентного колебания карбоксильной группы Асп-85, которая при низких температурах в кристалле на 4 см-1 ниже, чем в ПМ.

Идентичность частот ИК линий разностных спектров, относящихся к основному состоянию, как при комнатных, так и при низких температурах указывает на то, что структура основного состояния в кристаллах не возмущена. Прецизионное сравнение интенсивностей линий разностных спектров промежуточных состояний в амид I и II областях невозможно, поскольку кинетика фотоцикла ПМ и кристалла существенно различается, однако, спектры кристалла не содержат явных указаний на то, что амплитуда или характер структурных изменений в кристалле отличается от ПМ.

Кинетика фотоцикла BR в кристалле характеризуется ускоренным формированием М состояния и его замедленным распадом. Среди известных факторов, оказывающих аналогичный эффект на кинетику фотоцикла BR: 1) степень гидратации, 2) липидный состав ПМ и 3) pH. Повышенный, внутри кристалла pH наиболее хорошо согласуется с экспериментальными наблюдениями: ускоренным формированием М состояния, его замедленным распадом, наблюдаемым сдвигом частоты колебания карбоксильной группы Асп-85 и накоплением N состояния. Для того, чтобы проверить данное заключение, была проанализирована кристаллическая упаковка молекул BR. Кристалл образован стопкой двумерных кристаллических слоев, расстояние между поверхностями которых не превосходит 7-9. Поэтому в межслойном пространстве большая часть молекул воды является связанной с белком и липидами. Данная особенность кристаллической упаковки молекул может приводить к тому, что эффективный pH внутри кристалла выше, чем pH буфера, окружающего кристалл. Однако, частичная дегидратация и несколько измененный липидный состав также могут вносить вклад в изменение кинетики фотоцикла в кристалле.

Характеристика кристаллов SHII. Сравнение спектров поглощения SHII в кристалле и мембранах показало, что они одинаковы, следовательно кристаллическая упаковка не отражается на непосредственном окружении ретиналя. Функциональность SHII в кристаллах была изучена посредством сравнения кинетики фотоцикла в видимом диапазоне с кинетикой SHII в мембранах полярных липидов. Зависимость фотоиндуцированного изменения поглощения, характеризующего эволюцию M и О состояний фотоцикла SRII, показана на рис.8. Кинетика фотоцикла в кристалле отличается от кинетики в липидных мембранах, однако отличие в характерных временных константах фотоцикла не превышает 50% и не сказывается существенным образом на эволюции промежуточных состояний. Данные результаты также свидетельствуют о том, что окружение ретиналя в SRII не возмущено кристаллической упаковкой.

Исследование низкотемпературного К состояния SHII показало, что его спектры в видимом и ИК диапазонах идентичны в кристалле и мембранах, откуда можно заключить, что структурные изменения, сопровождающие формирование К состояния не искажены и не ограничены кристаллической упаковкой. Показано, что Рис.8. Зависимость фотоиндуцированного освещение кристалла светом с длиной волны изменения поглощения от времени для SHII на длинах волн 390 и 555 нм показана пунктиром 472 нм при 100оК приводит к накоплению для SHII в мембранах, сплошной линией - в кристалле.

~55% К состояния, что согласуется с результатом, полученным для SRII в мембранах.

Фиксация и характеристика М состояния SHII. Особенности кинетики М состояния SHII (формирование в течение 100 мкс и распад с характерным временем ~0.5 с) предполагают, что данное состояние может быть накоплено с высокой концентрацией при комнатной температуре при стационарном освещении светом с длиной волны в области близкой к 500 нм. Действительно, из спектра поглощения кристалла комплекса при постоянном освещении лазерным излучением с длиной волны 488 нм, было определено, что при данных условиях накапливается ~50% М состояния и ~15% О. Если размеры кристалла не превышают 200 мкм, то как следует из теоретических оценок, время его охлаждения потоком газообразного азота не превышает 200 мс, что в 2.5 раза меньше времени полураспада М состояния. Это означает, что распределение промежуточных состояний, накопленных при постоянном освещении, не изменяется существенным образом при таком охлаждении кристалла. Поэтому для фиксации М состояния кристалл замораживался при постоянном освещении. Показано, что данная процедура позволяет зафиксировать 60% М с примесью 15% О состояния (см. рис9.а) в кристалле.

Поскольку распределение промежуточных состояний не меняется при охлаждении, ИК спектр М состояния в кристалле, измеренный при постоянном освещении и комнатной температуре, характеризует структурные изменения, зафиксированные в кристалле при условиях измерения дифракционных данных.

Рис.9. а. Спектры поглощения кристалла SHII в основном состоянии (сплошная линия) и в зафиксированном М состоянии (пунктир) при 100оК. б. Разностные спектры М по отношению к основному состоянию при 294оК. Пунктиром показан спектр SHII в мембранах, сплошной линией - в кристалле.

Разностные спектры М состояния по отношению к основному для SHII в мембранах и кристалле представлены на рис.9.б. Линии спектра М состояния комплекса в кристалле и в мембранах имеют одинаковые частоты, следовательно, структурные изменения, сопровождающие формирование этого состояния имеют одинаковый характер в мембранах и кристалле. Из спектров можно заключить, что изомеризация ретиналя и перенос протона с ШО на Асп-75 происходят одинаково в мембране и кристалле. Однако, амид I и II линии, отражающие структурные изменения белка, имеют существенно меньшую интенсивность в кристалле, чем в мембранах. Следует отметить, что с помощью ЭПР спектроскопии было показано, что SRII и HtrII114, встроенные в мембраны полярных липидов, образуют функциональный комплекс, таким образом сравнение амплитуд инфракрасных спектров является корректным. Более того, эксперименты, выполненные с использованием поляризованного света и ориентированными мембранами со встроенным SHII, показали, что разница в интенсивности амид I и II линий не может быть объяснена дихроизмом. Таким образом, можно заключить, что амплитуда структурных изменений белка в кристалле значительно меньше, чем в мембранах.

Чтобы понять причины уменьшения амплитуды структурных изменений, была проанализирована упаковка молекул SHII в кристалле. Кристаллы SHII также, как и BR имеют слоистую структуру (см. рис.3). В плоскости бислоя молекулы образуют контакт посредством взаимодействия B и D спиралей рецептора, тогда как остальные спирали находятся в контакте с липидами и, возможно, незафиксированной частью трансдьюсера HtrII82-114, которые разупорядочены. Следовательно, окружение этих спиралей ближе к естественному, и их движение не ограничено кристаллическим взаимодействием в плоскости бислоя. Межслойный контакт между двумерно-кристаллическими слоями осуществляется посредством взаимодействия петель SRII: BC с одной и EF с другой стороны слоя. Причем, данное взаимодействие включает три водородные связи и, следовательно, несмотря на относительную гибкость петель, может ограничивать структурные изменения в данной области. В то же время, результаты ЭПР экспериментов указывают на то, что именно спираль F и петля EF претерпевают структурные изменения в М состоянии также, как в BR. Отсюда можно заключить, что именно межслойное взаимодействие молекул, ограничивает амплитуду структурных изменений, сопровождающих образование М состояния в кристалле.

Основные выводы четвертой главы:

1. Показано, что BR функционален в кристаллах. Кристаллическое окружение BR существенно изменяет кинетику фотоцикла, что отнесено на счет измененных свойств воды внутри кристалла и липидного окружения. Структурные изменения, сопровождающие промежуточные состояния одинаковы в ПМ и кристалле.

2. SRII в кристаллах комплекса SHII способен совершать фотоцикл. Кинетика фотоцикла в кристалле и в липидных мембранах не различается существенно. Показано, что кристаллическое взаимодействие молекул SRII приводит к уменьшению амплитуды структурных изменений, сопровождающих формирование М состояния, однако, не изменяет их характер.

3. Оптимизированы процедуры фиксирования низкотемпературных промежуточных состояний фотоцикла для BR и SHII в кристаллах. Данные процедуры были использованы для кристаллографических исследований структурных изменений этих белков в процессе их функционирования.

Основные результаты и выводы работы 1. В результате исследования поведения липидной кубической фазы в процессе кристаллизации BR с помощью дифракции нейтронов показано:

а) кубическая фаза сохраняет симметрию в течение всего процесса кристаллизации;

б) структурные изменения липидной фазы, сопровождающие инициацию кристаллизации, намного быстрее самого процесса кристаллизации.

2. Установлено, что концентрация детергента является важным кристаллизационным параметром. Ее оптимальный выбор позволил получить кристаллы BR, дающие дифракцию до разрешения 1.2.

3. В результате систематических исследований двойникования кристаллов BR обнаружена корреляция фактора двойникования со скоростью роста кристаллов.

Показано, что при замедлении роста, количество кристаллов без двойникования увеличивается.

4. Впервые показано, что двойниковые домены могут быть разделены без потери дифракционного качества, что позволило определить устройство двойниковых кристаллов и получить кристаллы BR без двойникования, дающие дифракцию до разрешения 1.35.

5. Развиты спектроскопические методики для характеристики кристаллов белков, позволяющие проведение экспериментов в видимом и ИК диапазонах с микросекундным временным разрешением на образцах с размером ~100 мкм.

6. Исследование кристаллов BR и комплекса SRII с HtrII спектроскопическими методами в видимом и ИК диапазонах продемонстрировало:

а. BR функционален в кристаллах, однако кристаллическое окружение существенно изменяет кинетику фотоцикла. При этом структурные изменения, сопровождающие промежуточные состояния, одинаковы в ПМ и кристалле.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»