WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Дифракционные измерения показали, что при данных кристаллизационных условиях, система MO/ОГ/BR/буфер образует кубическую фазу симметрии Pn3m, как и система МО/вода, однако постоянная решетки увеличена на 15-17 благодаря присутствию ~4% ОГ. Добавление сухой соли, приводит к уменьшению постоянной решетки кубической фазы на 10-30 (постоянная решетки уменьшается при увеличении концентрации соли) (см. рис.1.а). Все существенные изменения параметров системы завершаются в течение первых двух часов после добавления соли. При этом, во всех исследованных временных точках и при всех концентрациях соли в кристаллизационной системе присутствовала только кубическая фаза симметрии Pn3m.

Процесс уравновешивания кубической фазы, после добавления сухой соли, исследовался на установке малоуглового рассеяния нейтронов ЮМО (Дубна). Сразу после добавления соли система находится в неравновесном состоянии, как следует из уширения дифракционных пиков. При этом невозможно однозначно определить симметрию кубической фазы. Однако, принимая во внимание то, что симметрия определена однозначно до и после добавления соли и то, что позиция дифракционного пика имеет монотонную зависимость от времени, можно утверждать, что симметрия кубической фазы сохраняется в течение всего процесса кристаллизации. Причиной уширения пиков, по-видимому, является градиент концентрации соли в образце. Данные эксперименты показали, что характерное время изменений составляет 1.5-3ч. (см. рис.1.б), что примерно в 10 раз быстрее появления видимых кристаллов. В данных экспериментах присутствие липидных мезофаз, отличных от кубической фазы симметрии Pn3m, зафиксировано не было, таким образом, данное наблюдение противоречит ранее высказанному предположению о необходимости дестабилизации кубической фазы в направлении ламеллярной фазы для кристаллизации белка [6]. Однако, появление и рост белковых кристаллов может сопровождаться локальным возмущением кубической фазы и появлением ламеллярной фазы вокруг растущего кристалла. Такие микроскопические количества иной фазы были вне пределов чувствительности нейтронных экспериментов.

Анализ кинетики роста кристаллов показал, что видимые кристаллы появляются в течение 2-10 дней с начала кристаллизации, а их рост продолжался в течение одного месяца. С ростом концентрации соли время появления первых кристаллов сокращалось, а средний размер кристаллов уменьшался. Такая зависимость размера кристаллов от концентрации соли имеет характер аналогичный, найденному для кристаллов водорастворимых белков [8].

Исследование кубической фазы в более широком диапазоне кристаллизационных условий показало, что уменьшение концентрации МО в кристаллизационной системе приводит к увеличению размера кристаллов. При данных условиях постоянная решетки кубической фазы после добавления соли превышает 120. Предполагая, Рис.1. а. Зависимость постоянной решетки кубической что ОГ и BR встраиваются в липидный фазы от времени, отсчитываемого от момента добавления соли. Точка, помеченная стрелкой 1, измерена до бислой кубической фазы и принимая добавления соли, стрелкой 2 соответствует характерному времени появления видимых кристаллов. б. Характерная во внимание то, что кубическая фаза временная зависимость постоянной решетки кубической фазы в первые 3 часа после добавления соли.

МО симметрии Pn3m может находиться в равновесии с избытком буфера, параметрами, варьируемыми в данных сериях экспериментов, являются концентрация ОГ и BR в объеме кубической фазы.

Поэтому влияние каждого из этих факторов в отдельности на результат кристаллизации было исследовано более детально.

Влияние детергента на результат кристаллизации изначально было неясным. С целью исследования роли детергента были проведены кристаллизационные эксперименты, в которых все параметры, кроме концентрации детергента и фосфатной соли, были фиксированы. Результат, представленный на рис.2, свидетельствует о том, что размер кристаллов существенно зависит от концентрации ОГ. Кристаллы наибольших размеров 250-350 мкм были получены при концентрации ОГ от 10 до 16% и концентрации соли от 0.9 до 1.1 М. При этих условиях кристаллы растут в течение трех месяцев.

Повышение концентрации детергента в растворе белка от до 12-16% позволило увеличить размер кристаллов от 70 до мкм. Встраивание ОГ в кубическую фазу МО модулирует ее свойства. С одной стороны, увеличение концентрации детергента в данном интервале приводит к увеличению постоянРис.2. Контурная карта зависимости среднего размера ной решетки кубической фазы от кристаллов в пробе (в мкм) от концентрации ОГ в растворе белка и концентрации соли в пробе.

100 до 160. В результате средняя кривизна бислоя кубической фазы уменьшается, что приводит к уменьшению упругой энергии локальной деформации бислоя кубической фазы, вызванной присутствием белка. С другой стороны, встраивание ОГ приводит к уменьшению толщины гидрофобной составляющей липидного бислоя, поскольку эффективная длина алифатической цепи МО составляет 17.3, тогда как для ОГ она не превышает 12.3.

Мы предполагаем, что данный эффект приводит к уменьшению гидрофобной составляющей свободной энергии ассоциации молекул BR в кристалл, возникающей как результат несоответствия толщины гидрофобной области липидного бислоя кубической фазы (34 ) и белка (~30 ). Поскольку добавление ОГ уменьшает данное несоответствие, это приводит к уменьшению скорости роста и плотности зародышеобразования кристаллов и увеличению их конечного размера. Данные результаты указывают на то, что свободная энергия, возникающая в результате взаимодействия белка с липидной фазой, вносит существенный вклад в энергетику процесса кристаллизации и может непрерывно модулироваться посредством изменения концентрации детергента в кристаллизационных экспериментах.

На следующем шаге оптимизации кристаллизационных условий было показано, что из нескольких гомологичных липидов: МО, моноваценина и монопальмитолеина, наиболее подходящим для кристаллизации BR является МО. Были оптимизированы концентрация белка и pH кристаллизационной системы. В результате получены кристаллы, дающие наиболее высокое дифракционное разрешение на настоящий момент (см. табл.1).

Литератур Полученные Табл.1. Сравнение опубликованных и полученных в данной ные в данной работе кристаллографических данных наивысшего разрешения данные работе кристаллов BR.

разрешение, () 1.55 1.Двойникование кристаллов BR. Кристаллам BR с Фактор пространственной группой P63, выращенным в 24 двойникования % Количество кубической фазе, свойственно мероэдрическое уникальных 34 002 рефлексов двойникование, при котором кристалл состоит из Rsym (%) 6.9 (38.1) 7.2(34.0) доменов с двумя различными ориентациями, (для такими, что рефлексы hkl доменов с одной внешней 19.9(2.0) 5.5(2.1) оболочки) ориентацией накладываются на kh-l доменов с Постоянные 60.6,60.6, 60.74, 60.74, другой. Взаимная ориентация решетки, a,b,c, () 108.2 110.кристаллографических осей доменов, соответствующая данному типу двойникования, и предполагаемая ориентация доменов в кристаллах BR показаны на рис.3.

В литературе информация о строении двойниковых белковых кристаллов: размере доменов и их организации достаточно бедная, также как и о методах устранения двойникования.

Для выявления ключевых факторов, Рис.3. а. Взаимная ориентация кристаллографических осей двойниковых доменов кристалла влияющих на двойникование, были BR. б. Предполагаемая организация двойниковых доменов в кристалле. Схематически показана проведены объемные систематические ориентации молекул BR на границе доменов.

исследования. При этом была обнаружена корреляция частоты встречаемости кристаллов с низким фактором двойникования со скоростью роста кристаллов. Уменьшение скорости роста, вне зависимости от других условий кристаллизации, приводило к увеличению вероятности обнаружения кристалла с низким фактором двойникования. Распределение фактора двойникования, построенное для 83 кристаллов, дающих дифракцию высокого разрешения, время роста которых не превышало 1.5 месяцев и для 111 кристаллов, которые росли более 3-х месяцев показано на рис.4. При медленном росте количество кристаллов без двойникования (фактор двойникования < 10%) составляет 14%, тогда как при более быстром росте кристаллы без двойникования не были обнаружены, а общее количество кристаллов с фактором двойникования менее 25% составляло 8%. Данный результат впервые демонстрирует, что кинетика роста кристаллов является существенным фактором, определяющим вероятность возникновения двойникования.

Расщепление двойниковых кристаллов. Кристаллизационные пробы, как правило, содержат большое количество кристаллов различных размеров и формы.

Некоторые кристаллы выглядят, как две слипшиеся гексагональные пластинки.

Поскольку взаимная ориентация слипшихся пластинок аналогична предполагаемой ориентации двойникоРис.4. Распределение фактора двойникования для кристаллов, которые росли менее 1.5 месяцев (пустые вых доменов (рис.3), было высказано прямоугольники), более 3-х месяцев (заштрихованные).

предположение о том, что данный дефект кристаллов и двойникование имеют одинаковое происхождение. Поэтому были проведены эксперименты по расщеплению кристаллов.

Было найдено, что медленное уменьшение концентрации соли от 3 до ~1 М в маточном растворе кристалла приводит к расщеплению слипшихся пластинок. Некоторые расщепленные кристаллы давали дифракцию достаточно высокого разрешения для определения фактора двойникования, который во всех случаях оказался равным 0 с точностью экспериментальной погрешности (5%).

Аналогичная процедура, примененная к кристаллам, у которых отсутствовали явные признаки, указывающие на присутствие двойниковых доменов, позволила расщепить кристаллы вдоль плоскости шестиугольника. Большинство кристаллов расщепилось на две части примерно одинаковой толщины (рис.5а,б) и несколько кристаллов на три и большее количество частей. В случае нескольких кристаллов расщепленные части дифрагировали до того же разрешения, что и исходный кристалл. Как показали тесты, основанные на статистике Етеса и графике Бриттона, все расщепленные кристаллы, дающие дифракцию, не имели двойникования, в то время как фактор двойникования исходных кристаллов был около 40% (рис.5.б).

Данные эксперименты позволили показать, что двойниковые кристаллы состоят из макроскопических доменов, представляющих из себя гексагональные пластинки, размеры которых в плоскости шестиугольника совпадают с размерами всего кристалла и их толщина сравнима с толщиной исходного кристалла. Во всех случаях, когда отщепленные части давали Рис.5. а. Фотография кристалла BR до и б. после расщепления. в.

дифракцию, они не имели Распределение Етеса и г. граффик Бриттона до и после двойникования, следовательно, расщепления кристалла.

можно предположить, что кристаллы расщепляются вдоль границы контакта двойниковых доменов. Основываясь на этом предположении можно заключить, что большинство кристаллов BR состоит из двух двойниковых доменов. В этом случае расщепление на три и большее количество частей свидетельствует о том, что некоторые кристаллы состоят из большего количества доменов, однако их размер всегда сравним с размером двойникового кристалла.

Поверхность раздела двойниковых доменов может быть образована посредством контакта либо цитоплазматических (ЦП), либо внеклеточных (ВК) поверхностей BR (рис.3). Тот факт, что фактор двойникования большинства кристаллов BR превышает 30%, и большинство кристаллов состоит из двух двойниковых доменов, может быть объяснен различием энергий взаимодействия ЦП и ВК поверхностей двумерных кристаллов BR. ВК поверхность BR практически нейтральна, в то время как ЦП поверхность заряжена отрицательно. Поскольку взаимодействие между двумерными слоями BR в кристалле достаточно слабое, даже слабое электростатическое отталкивание двумернокристаллических ЦП поверхностей может вносить существенный вклад в общую энергию межслойного взаимодействия, что подтверждается фактом расщепления доменов при понижении концентрации соли. Таким образом, процесс роста кристалла представляется нам следующим образом. Первый двойниковый домен появляется вскоре после зародышеобразования кристалла или даже в процессе зародышеобразования. Данные домены взаимодействуют ВК поверхностями. У получившегося двойникового кристалла внешние гексагональные поверхности - ЦП поверхности, вероятность образования двойников на которых существенно меньше, из-за электростатического отталкивания.

Следовательно, с высокой вероятностью кристалл продолжает расти без образования новых двойниковых доменов.

Основные выводы третьей главы:

1. Симметрия кубической фазы сохраняется в течение всего процесса кристаллизации.

Присутствие мезофаз, отличных от Pn3m кубической фазы, не обнаружено, следовательно не является необходимым условием кристаллизации.

2. Структурные изменения липидной фазы, сопровождающие инициацию кристаллизации намного быстрее самого процесса кристаллизации, следовательно только равновесное состояние кубической фазы после добавления осадителя определяет процесс роста и свойства кристаллов.

3. Концентрация детергента является важным кристаллизационным параметром. Ее оптимальный выбор позволяет существенно улучшить дифракционное разрешение кристаллов.

4. Двойниковые кристаллы BR могут быть расщеплены на одиночные домены с сохранением их дифракционных свойств.

Четвёртая глава посвящена характеристике белков в кристаллах и поиску оптимальных условий фиксирования низкотемпературных промежуточных состояний для рентгеноструктурного анализа. В качестве экспериментальных методов были использованы спектроскопия в видимом и инфракрасном диапазонах. Тогда как первый метод позволяет определить состав и концентрации промежуточных состояний, разностная инфракрасная спектроскопия позволяет получить качественную информацию о характере структурных изменений, сопровождающих формирование промежуточных состояний. Для характеристики основного и промежуточных состояний белков в кристаллах эксперименты выполнялись с белком, встроенным в липидные мембраны, и кристаллами при одинаковых условиях.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»