WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |
на правах рукописи УДК 533.9 ЕФРЕМОВ РУСЛАН ГЕННАДЬЕВИЧ Исследование структуры и механизма функционирования ретинальсодержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах 03.00.02. – биофизика автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2005 Работа выполнена в Московском физико-техническом институте, Лаборатории нейтронной физики им. И.М. Франка Объединенного института ядерных исследований (г.

Дубна) и Институте структурной биологии Исследовательского центра г. Юлиха.

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук Валентин Иванович Горделий Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Марк Александрович Мокульский кандидат физико-математических наук Виктор Борисович Киреев Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (г. Москва) Защита состоится 2005 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «» _ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук В.Е. Брагин 1 Общая характеристика работы Введение. Актуальность проблемы. Трансмембранные белки выполняют важнейшие функции в составе организма, и в то же время структурная информация об этих белках является относительно бедной. Это связано в первую очередь с трудностями кристаллизации мембранных белков [1]. Один из наиболее исследованных мембранных белков - ретиналь-содержащий белок, бактериородопсин (BR), является простейшим фотозависимым генератором трансмембранного потенциала. Поглощение света BR инициирует фотоцикл, в результате которого протон переносится из цитоплазмы во внеклеточное пространство. Исследование BR является чрезвычайно важным для понимания того, каким образом в природе реализуется активный транспорт ионов.

Гомологичный BR, сенсорный родопсин II (SRII) - фоторецептор синего света, активирующий двухкомпонентный сигнальный каскад, одну из самых распространенных в природе сигнальных цепей [2]. SRII образует комплекс с трансмембранным трансдьюсерным белком, HtrII. Поглощение света SRII, как и в случае BR, инициирует фотоцикл, в результате которого сигнал передается на HtrII. Чтобы понять механизмы функционирования данных белков, необходимо знать их молекулярную структуру как в состоянии покоя, так и на различных стадиях транспорта протона или передачи сигнала.

В результате использования липидной кубической фазы, в качестве матрицы для кристаллизации, впервые удалось получить кристаллы BR, позволившие определить его структуру в основном и промежуточных состояниях фотоцикла с разрешением, достигающим 1.55. Таким образом были определены детали структурных изменений, сопровождающих фотоцикл, как например: переориентация аминокислотных остатков, деформация -спиралей и движение молекул воды [3;4]. Однако, структуры некоторых из промежуточных состояний BR, полученных разными группами, сильно различаются, что ведет к противоречивым заключениям относительно механизма переноса протона.

Причинами этого являются: недостаточно высокое разрешение дифракционных данных, мероэдрическое двойникование кристаллов (понижающее информативность дифракционных данных) и недостаточно полная характеристика промежуточных состояний при условиях кристаллографических экспериментов [5].

Структура SRII в комплексе с трансмембранным фрагментом HtrII114, (SHII), была определена с помощью рентгеноструктурного анализа, тогда как его структура в сигнальном состоянии остается неизвестной. Определение структурных изменений, сопровождающих формирование сигнального состояния SHII, важно для понимания механизмов передачи сигнала между белками.

Цель и задачи исследования заключались в улучшении дифракционного качества белковых кристаллов, выращенных в липидной кубической фазе, исследовании влияния кристаллического окружения белков на их функциональность спектроскопическими методами и определении оптимальных условий фиксирования промежуточных состояний белков в кристаллах при низких температурах.

Научная новизна. В работе впервые применен метод дифракции нейтронов для изучения механизма кристаллизации в кубической фазе. Благодаря этому оказалось возможным исследование эволюции свойств липидной фазы в процессе кристаллизации и роста кристаллов на одних и тех же образцах. В процессе оптимизации кристаллизационных условий было обнаружено, что концентрация детергента является важным кристаллизационным параметром, и ее оптимальный выбор позволяет существенно улучшить дифракционное качество кристаллов и воспроизводимость кристаллизационных экспериментов. В данной работе впервые показано, что двойниковые кристаллы белка могут быть расщеплены на одиночные без нарушения кристаллической структуры.

Предложенный подход позволил получить кристалл BR без двойникования, с которого были собраны дифракционные данные с разрешением 1.35.

В результате разработки нового экспериментального оборудования впервые удалось провести спектроскопические эксперименты на белковых кристаллах с микросекундным временным разрешением в инфракрасном диапазоне. Это дало возможность установить влияние кристаллического окружения и кристаллической упаковки белков на их функциональность. В комбинации с низкотемпературной спектроскопией данный подход позволил наиболее детальную характеристику зафиксированных в кристалле промежуточных состояний.

Практическое значение работы. Работа представляет общий интерес для белковой кристаллографии. В частности, результаты исследования механизма кристаллизации в кубической фазе представляются важными для кристаллизации и развития методики кристаллизации мембранных белков. Новые подходы к решению проблем двойникования могут быть использованы в других лабораториях для устранения данного дефекта белковых кристаллов.

Развитые в работе спектроскопические методы характеристики белковых кристаллов представляют интерес для кристаллографических исследований механизмов функционирования белков, поскольку позволяют сравнивать химические и структурные изменения, сопровождающие функционирование белков в кристалле, с изменениями, сопровождающими их функционирование в естественном окружении. Кроме того, данные результаты могут найти применение в видимой и инфракрасной микроспектроскопии, в частности, для исследования биологических тканей и отдельных клеток. Также микроспектроскопия в комбинации с проточной кюветой может найти применение в исследовании нециклических биореакций.

Апробация работы. Основные положения работы и ее отдельные результаты докладывались на 28-й международной конференции "Dynamical properties of solids" (Керкраде, Нидерланды, 2001), 11-й международной конференции "Retinal proteins" (Фрауэнхимзе, Германия, 2004), 14 международной конференции по росту кристаллов (Гренобль, Франция, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Объём и структура диссертации. Работа состоит из введения, 4 глав, заключения и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 121 страницу машинописного текста, включая 61 рисунок, 12 таблиц и 176 библиографических ссылок.

Основное содержание работы Во введении показана актуальность исследуемой темы, перечислены основные проблемы, стоящие в данной области, сформулированы цели и главные идеи работы, а также кратко описана структура диссертации.

Первая глава посвящена обзору литературных данных. В обзоре рассмотрены основные характеристики археродопсинов, к которым принадлежат BR и SRII:

распространенность, функции и отношение к другим ретиналь-содержащим белкам.

Подробно описано современное представление о механизме функционирования BR и SRII. Особое внимание уделено использованию спектроскопических методов для получения структурной и кинетической информации о фотоциклах белков. Здесь же критически рассмотрены кристаллографические структуры промежуточных состояний фотоцикла BR. Показано, что вследствие недостаточной точности определения кристаллографических координат в предыдущих работах, невозможно однозначно судить о механизме функционирования белка.

Кроме этого, в обзоре литературы рассмотрены принципы кристаллизации мембранных белков. Подробно описана методика кристаллизации в липидной кубической фазе, которая состоит из двух принципиальных шагов: 1) смешивания раствора белка с липидом и последующей гомогенизации, в результате чего образуется кубическая фаза со встроенным в ее бислой белком, и 2) добавления осаждающего вещества (в данном случае, сухой фосфатной соли) инициирующего кристаллизацию. Поскольку для рациональной оптимизации кристаллизационных условий необходимо знать механизм кристаллизации белка в липидной системе, в данной главе описаны эксперименты, в которых исследовалась кристаллизационная система, и предложенные механизмы кристаллизации. Было показано, что добавление соли приводит к уменьшению постоянной решетки кубической фазы, и что рост кристаллов сопровождается локальным появлением ламеллярной фазы. Отсюда сделаны выводы о том, что дестабилизация кубической фазы и упругая энергия локального изменения кривизны бислоя, вокруг встроенного в него белка, играют важную роль в кристаллизации [6]. Литературный обзор также включает описание явления двойникования в кристаллах, методов его детектирования и характеристики. В заключении суммированы проблемы, стоящие на пути понимания механизмов функционирования археродопсинов, и являющиеся предметом исследования в данной работе. Показано, что рентгеновская кристаллография является наиболее подходящим методом для их решения.

Во второй главе описаны материалы и методы, использованные в работе. Подробно описаны процедуры получения, очистки и кристаллизации белка. Рассмотрены основные принципы дифракции нейтронов на поликристаллических объектах и дано краткое описание экспериментальных установок, на которых выполнялись эксперименты по дифракции нейтронов и рентгеновских лучей. Здесь же описаны методы определения фактора двойникования и, предложенный в данной работе, метод расщепления двойниковых кристаллов.

Особое внимание уделено описанию спектроскопических методов, использованных в работе. Рассмотрены основные принципы измерения спектроскопических данных с временным разрешением, принципы Фурье-спектроскопии, устройство экспериментальной установки, использованной для проведения спектроскопических экспериментов на белковых микрокристаллах и процедуры приготовления образцов.

Детально описано устройство созданной в работе установки для импульсного фотолиза, разработанной специально для микроспектроскопии. В заключении рассмотрены методы обработки спектроскопических данных, измеренных с временным разрешением.

Третья глава. Одной из целей работы являлось улучшение качества дифракции кристаллов BR, что требовало оптимизации условий кристаллизации. Основное отличие кристаллизации в кубической фазе от классических методов состоит в том, что белок кристаллизуется не из водного раствора, а из липидной кубической фазы, в бислой которой он встроен. Поскольку данный метод кристаллизации является новым, вопросы о поведении кубической фазы и ее роли в процессе кристаллизации не были детально исследованы. В то же время эта информация представляется критической для формулирования оптимальной стратегии оптимизации кристаллизационных условий.

Процесс кристаллизации в кубической фазе определяется взаимодействием белка с липидно-детергентной составляющей системы, в данном случае моноолеином (МО) и октилглюкозидом (ОГ), и взаимодействием белок-осадитель. Одна из основных составляющих белок-липидного взаимодействия имеет гидрофобный характер и в первом приближении определяется геометрическими параметрами липидной фазы (толщина гидрофобной части и кривизна липидного бислоя). Взаимодействие белка с фосфатной солью имеет электростатический характер. Кроме этого, соль меняет активность воды, меняя таким образом концентрацию воды в липидной фазе и, следовательно, ее состояние.

Исходя из данной модели оптимизация кристаллизационных условий была разбита на две принципиальных подзадачи:

1. Определение влияния структуры липидной фазы на результаты кристаллизации, то есть определение оптимальной геометрии липидной системы для кристаллизации.

2. Оптимизация параметров осадителя и концентрации белка при постоянных параметрах липидной фазы.

В качестве метода для решения первой подзадачи была выбрана дифракция нейтронов*. Данный метод позволяет с одной стороны определить из каких липидных мезофаз состоит исследуемый образец и структурные параметры данных мезофаз. С другой стороны, благодаря высокой проникающей способности нейтронов, он позволил провести эксперименты с реальными кристаллизационными пробами, используемыми при получении кристаллов BR для рентгеноструктурных исследований, что позволило установить соответствие между поведением липидной фазы и кристаллизацией белка.

* Эксперименты по дифракции нейтронов выполнены совместно с Г.Н. Ширяевой.

Вторым шагом по оптимизации дифракционного качества кристаллов была последовательная вариация кристаллизационных параметров. При этом фиксировались результаты кристаллизации: размеры кристаллов, качество дифракции и фактор двойникования. Необходимо подчеркнуть, что проведенные нейтронографические исследования позволили впервые установить важность концентрации детергента для кристаллизации мембранных белков.

При использовании "стандартных" [7] кристаллизационных условий первые видимые кристаллы (~5-10 мкм) появляются через 2-3 дня после добавления сухой соли. Этот промежуток времени был выбран в качестве временного масштаба эксперимента, поскольку одна из основных стадий роста кристалла, зародышеобразование, происходит в пределах данного временного интервала.

Состояние кристаллизационной системы MO/ОГ/BR/буфер (250мМ Na/K-Pi, pH 5.6), изучалось в следующие моменты кристаллизации: 1) уравновешенная в течение 24 ч.

кристаллизационная смесь без соли, 2) после добавления соли каждые 2 ч. в течение 8 ч. и 3) через 2 д. после добавления соли.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»