WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

КАРАМЫШЕВ Алексей Владимирович ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПОЛИАНИЛИНА, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ОКСИДОРЕДУКТАЗАМИ 02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва – 2007

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный консультант:

ведущий научный сотрудник, доктор химических наук, профессор Сахаров Иван Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович доктор химических наук Сергеев Владимир Глебович

Ведущая организация:

Институт Молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « 29 » мая 2007 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1 стр.11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан апреля 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В 2000-м году Нобелевская премия по химии была присуждена исследователям Хидеки Сиракава (Hideki Shirakawa, Япония), Алану МакДиамиду (Alan G. McDiarmid, США) и Алану Хигеру (Alan J. Heeger, США) за “открытие и развитие области электронопроводимых полимеров’.

Электропроводящие полимеры образовали новый класс “синтетических металлов”, обладая исключительными свойствами в сравнении с низкомолекулярными полупроводниками. На настоящий момент они нашли широкое применение в различных областях науки и техники от микроэлектроники (батареи, оптические мониторы) до аналитической практики (сенсоры). Полианилин привлекает наибольшее внимание благодаря своей высокой стабильности и хорошим проводящим характеристикам. Более того, в присутствии хирального индуктора (например, энантиомеров камфорсульфоновой кислоты) он способен образовывать оптически активные вторичные структуры, что может позволить существенно расширить область применения этого полимера, в частности в качестве селектора для разделения оптически активных соединений. К сожалению, основные способы получения (химический и электрохимический) полианилина обладают определенными недостатками, что вызывает необходимость в разработке альтернативных подходов.

В последние годы появляется все больше работ, посвященных ферментативной полимеризации, как альтернативному способу получения полимеров. Ранее была показана принципиальная возможность проведения ферментативной полимеризации анилина с образованием электропроводящих полиэлектролитных комплексов на основе полианилина при использовании пероксидазы хрена как биокатализатора. Однако, как оказалось, в условиях, необходимых для синтеза (кислая среда), этот ферментный препарат быстро теряет свою активность. Таким образом, становятся понятным актуальность диссертационной работы, посвященной ферментативному синтезу полианилина, катализируемого кислотостабильными оксидоредуктазами.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы явился поиск высокоактивных и кислотостабильных оксидоредуктаз, способных в экологически чистых условиях эффективного катализировать полимеризацию анилина с образованием электропроводящего и оптически активного полианилина.

Основными задачами

настоящей работы являлись:

Исследование возможности использования лакказы Coriolus hirsitus и пероксидазы из листьев Королевской пальмы в качестве биокатализаторов для проведения ферментативного синтеза полианилина Оптимизация методик ферментативного синтеза проводящих полиэлектролитных комплексов полианилина с сульфополистиролом и поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропан)сульфокислота Изучение ферментативного синтеза хирального полианилина, катализируемого пероксидазой пальмы, на мицеллах додецилбензолсульфоновой кислоты Определение физико-химических свойств и структуры полианилина, полученного ферментативным путем.

Научная новизна работы и практическая значимость работы.

Впервые проведен ферментативный синтез полиэлектролитных комплексов на основе полианилина с использованием двух кислотостабильных оксидоредуктаз – лакказы Coriolus hirsitus и пероксидазы из листьев Королевской. Показано, что в процессе реакции образуется проводящий полианилин с улучшенными характеристиками в экологически чистых условиях. Впервые проведен ферментативный синтез хирального полианилина на мицеллах додецалбензолсульфоновой кислоты, катализируемый пероксидазой пальмы. Показано, что хиральный полианилин может образовываться в отсутствие хирального индуктора (энантиомера камфорсульфоновой кислоты) при ферментативной полимеризации анилина.

Изучена морфология ферментативно синтезированного хирального полианилина, представляющего из себя пористые рисоподобные частицы длиной порядка 180нм.

Апробация работы.

Основные результаты работы представлены на международных конференциях: “Биокатализ-2002” (Москва, Россия, 2002), Конференция молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда им. И.В. Березина “Инженерная энзимология” (Москва, Россия, 2002-2003), “Биотехнология:

состояние и перспективы развития”, (Москва, Россия, 2002, 2003 и 2007), “European Chemistry Congress, Polymer architecture – from structure to functional control” (Будапешт, Венгрия, 2006) и EUROBIC8 (Авейро, Португалия, 2006).

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 5 тезисов докладов на международных конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 95 ссылок. Работа изложена на страницах 105 и включает в себя 38 рисунков и 6 таблиц Сокращения, принятые в тексте.

ПАНИ – полианилин, ПП - пероксидаза из листьев Королевской пальмы, СПС – сульфополистирол, ПАМПС - поли(2-акриламидо-2-метил-1пропан)сульфокислота, ДБСК – додецилбензолсульфо-кислота, КСК – камфорсульфоновая кислота.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ I. Ферментативный метод синтеза полиэлектролитных комплексов электропроводящего полианилина, используя грибную лакказу и пероксидазу пальмы в качестве биокатализаторов.

Так как для образования полиэлектролитного комплекса ПАНИ с анионной полимерной матрицей синтез ПАНИ необходимо проводить при рН ниже рКа аминогруппы анилина (4.6), из бобов сои из корней хрена стабильность фермента в кислых 40 из арахиса, катионная изоформа из арахиса, условиях являлась обязательной. На рис.

анионная изоформа из листьев пальмы 1 представлены рН зависимости стабильности пяти различных 2 3 4 5 6 7 пероксидаз растений. Видно, что при pH кислых рН наиболее стабильной Рис. 1: рН-стабильность растительных пероксидаз является пероксидаза, выделеная из листьев Королевской пальмы. Поэтому в качестве одного из используемых биокатализаторов ферментативной полимеризации анилина нами был выбран этот фермент. Другим ферментом, исользованным нами в синтезе ПАНИ, была кислотостабильная лакказа Coriolus hirsitus.

В качестве полимерных матриц для синтеза полиэлектролитных комплексов электропроводящего ПАНИ использовались СПС и ПАМПС.

Преимущество использования СПС и ПАМПС заключается прежде в том, что ситезитующийся полианилин, взаимодействуя с такими полимерами, образует стабильные дисперсные растворы полиэлектролитных комплексов, тем самым препятствуя агрегации полианилиновых молекул и выпадению их в осадок.

Кроме того, сульфосодержащие матрицы способствуют ориентации молекул анилина таким образом, чтобы полимеризация анилина проходила по механизму «голова – хвост» с образованием линейных молекул 0,полианилина. Более того, сульфогруппы, содержащиеся в СПС и ПАМПС, допируют образующийся 0,полианилин, делая его электропроводящим.

Для оптимизации условий 0,ферментативного синтеза полианилина 2,5 3,0 3,5 4,0 4,были проварьированны кислотность pH среды и концентрации реагирующих Рис. 2: рН зависимость реакции ферментативного синтеза полиэлектролитного комплекса ПАНИ/ПАМПС, катализивеществ.

руемого ПП На рис. 2 представлена рНзависимость реакции ферментативной полимеризации анилина, катализируемая ПП. рН-зависимость имеет колоколообразный вид, а оптимальное значение рН активность, % 400нм А в этом случае равно 3,5. Аналогичный характер носила и рН-зависимость ферментативной полимеризации анилина, катализируемой лакказой, только в этом случае рН-оптимум лежал при рН 3,5 – 3,7.

Зависимости концентрации анилина на скорость ферментативного синтеза ПАНИ для двух оксидоредуктаз 15 30 50 75 100 несколько отличались (рис. 3). Так, при [анилин], мМ повышении концентрации анилина до Рис. 3: Влияние концентрации анилина на ферментамМ в реакции, катализируемой лакказой, тивный синтез ПАНИ, катализируемый лакказой (черные кружки) и ПП (белые кружки).

наблюдается повышение скорости реакции. Дальнейшее же увеличение концентрации анилина приводило к падению скорости реакции, что, по-видимому, было вызвано субстратным ингибированием лакказы. Если же в качестве биокатализатора использовалась ПП, то эффекта ингибирования фермента анилином не наблюдалосься во всем интервале исследуемых концентраций, и скорость реакции ферментативного синтеза ПАНИ увеличивается с увеличением концентрации анилина, что позволяет использовать ПП с максимальной эффективностью.

С увеличением концентрации полимерной матрицы происходило снижение скорости ферментативной полимеризации, катализируемой как ПП, так и лакказой (рис. 4). Это, вероятно, объясняется связыванием анилина с СПС и уменьшением концентрации свободного анилина в реакционной среде, который может участвовать в каталитическом цикле 0 10 20 30 40 50 ферментов. Необходимо также [СПС], мМ отметить, что существенным является Рис. 4: Влияние концентрации полимерной матрицы на реакцию ферментативного синтеза полиэлектроне просто концентрация матрицы в литного комплекса ПАНИ, катализируемую лакказой растворе, а соотношение концентраций анилина и мономерного звена полимерной матрицы. Так, если это соотношение было меньше 1:1, то образывались стабильные дисперсионные растворы полиэлектролитных комплексов ПАНИ, тогда как при соотношении выше 1:наблюдалось выпадение ПАНИ в осадок.

Когда в качестве биокатализатора используется ПП, то в роли окислителя выступает пероксид водорода, который, как известно, при высоких концентрациях ингибирует пероксидазу. На рис. 5 (А) представлена зависимость скорости реакции ферментативного синтеза ПАНИ, катализируемого ПП, от концентрации Н2О2. При концентрации Н2О2 ниже 0,мМ скорость реакции растет с увеличением концентрации Н2О2. При более высоких концентрациях окислителя скорость реакции начинает падать. Если же 400нм А 400нм А для той же реакции рассматривать зависимость выхода продукта реакции 0,от концентрации Н2О2 (рис. 5 (Б)), то А выход продукта увеличивается с 0,увеличением концентрации окислителя вплоть до 5-15 мМ и лишь 0,при более высоких концентрациях реакция резко снижается.

0,Обнаруженная зависимость объясниться тем, что при концентрации Н2О2 ниже 0,5 мМ 0,реакция идет по традиционному «пинг-понг» механизму 0 5 10 15 пероксидазного катализа, где [H2O2 промежуточными продуктами ], мМ пероксидазы (Е) являются активные соединения Е1 и Е2 (сх. 1, уравнения 0,(1) - (3)). Затем в интервале Б концентраций окислителя 0,5 – мМ, когда скорость реакции начинает 0,уже падает, а выход продукта еще увеличивается, происходит 0,образование соединения Е3 (сх. 1, уравнение (4)), которое хотя и менее активно, чем Е1 и Е2, но все же окисляет анилин. И наконец при 0 5 10 15 [H02], мМ концентрациях пероксида водорода Рис. 5: Влияние концентрации пероксида водорода выше 15 мМ происходит образование на скорость реакции (А) и выход продукта (Б) при ферментативном синтезе полиэлектролитного комп- неактивной формы пероксидазы – лекса ПАНИ/СПС, катализируемом ПП бердопротеина-670 (сх. 1, уравнение (5)) и реакция прекращается.

E + H2O2 E1 + H2O (1) E1 + S E2 + P (2) E2 + S E + P (3) E2 + H2O2 E3 + H2O (4) E1 + H2O2 (E1.H2O2) P-670 (5) Схема 1: Каталитический цикл пероксидазы и реакции ее инактивации.

На рис. 6 (А) представлена кинетика реакции полимеризации анилина, катализируемой лакказой. Как видно, реакция продолжалась в течение 6 суток, и практически все это время фермент оставался в активном состоянии. Вместе с тем, несмотря на высокую концентрацию в системе фермента, скорость реакции оставалась невысокой, что связано с низкой концентрацией /мин скорость реакции, A 400нм А растворенного в реакционной среде молекулярного кислорода (0,2 мМ), А играющего роль окислителя при полимеризации анилина. В то же время, при ферментативном синтезе полианилина, катализируемом ПП, мы можем использовать более высокие концентрации окислителя (пероксида водорода) и, как видно из кинетической кривой этой реакции (рис. 6 (Б)), скорость процесса при этом значительно возрастает. Более того, после однократного добавления 0 3 6 9 Н2О2 реакция заканчивалась спустя 10 t, дни мин, и при добавлении новой порции окислителя вновь продолжается, что Б говорит о сохранении ферментом своей активности и о возможности проведения максимально эффективного окисления анилина.

Таким образом, нам удалось оптимизировать условия ферментативного синтеза полиэлектролитных комплексов ПАНИ, с использованием в качестве 0 100 200 300 400 t, мин биокатализаторов лакказы и ПП.

Рис. 6: Кинетика ферментативного синтеза полиэлектроРезультаты оптимизации представлены литного комплекса ПАНИ/СПС, катализируемого лакказой (А) и ПП (Б) в табл. 1.

Таблица 1. Оптимальные условия синтеза полиэлектролитных комплексов полианилина.

Фермент рН Анилин, мМ СПС, мМ ПАМПС, мМ Н2О2, мМ лакказа 3.7 50 50 - ПП 3.5 100 100 - ПП 2.8 50 - 50 0.400нм А 400нм А II. Физико-химические характеристики полиэлектролитных комплексов на основе полианилина, синтезированных с помощью оксидоредуктаз.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»