WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Эмбрионы с опухолеподобными структурами не имеют пищеварительной системы (Рис. 8, Б). Практически все внутреннее пространство заполнено мезенхимными клетками. Однако в центре эмбриона сохраняется небольшое свободное пространство – остаток бластоцеля.

Таблица 1. Частота встречаемости ОПС у эмбрионов S. intermedius и S. nudus, культивируемых с разными штаммами A. tumefaciens (через 28 часов после оплодотворения).

Агробактериальные векторы % эмбрионов с ОПС S. intermedius S. nudus Контроль (без обработки) 0 pPCV002 + полная функция vir (pMP90RK) 1.2 ±0.1 1.6 ± 0.pPCV002-rolC + полная функция vir 4.5 ± 0.4 5.5 ± 0.(pMP90RK) pPCV002-rolC + мутация virA (pTi237) 0.8 ± 0.1 1.2 ± 0.pPCV002-rolC + мутация virB (pTi243) 0.6 ± 0.1 1.2 ± 0.pPCV002-rolC + мутация virG (pTi19) 0.3 ± 0.2 0.8 ±0.pMP90RK (только функция vir) 0.4 ± 0.2 1.0 ± 0.Штаммы содержат различные плазмиды, несущие ген rolC.

Рис. 7. Внешний вид эмбрионов Scaphechinus mirabilis, обработанных плазмидой pMA563, несущей ген gal4 (60 часов после оплодотворения). А – контрольный эмбрион (плутеус), Б, В – эмбрионы с ОПС. Линейка 20 мкм.

На полутонких срезах хорошо видно, что опухолеподобные структуры представлены рыхлым скоплением клеток и, очевидно, возникают из-за разрыва эктодермы эмбриона и выселения части чрезмерно развитой мезенхимы наружу. По-видимому, экспрессия gal4 приводит к увеличению пролиферативной активности эмбриональных клеток морских ежей, как это было показано на первичных культурах эмбриональных клеток морских ежей (Bulgakov et al., 2002). К какому зачатку (эктодерма или энтодерма) следует относить поверхностный эпителий зародыша с опухолеподобной структурой, морфологически определить невозможно, поэтому мы характеризуем его как внешний слой клеток. Из этого следует, что, несмотря на неорганизованный рост клеток внутренней массы, после трансфекции геном gal4, клетки претерпевают детерминацию, т. к. в таких эмбрионах можно различить эпителиальные структуры и производные мезодермы. Кроме того, наблюдаемые в этом случае процессы изменения хода эмбриогенеза при формировании ОПС сильно отличаются от таковых, имеющих место при экзогаструляции, где при вегетализации эмбриона сдвиг детерминации клеточных полей эмбрионов происходит в энто-мезодермальном направлении. Механизмы, по которым запускается ненормированный рост мезенхимы эмбрионов, неизвестен. Скорей всего, это происходит благодаря активации гена эпидермального фактора роста (ЭФР) морских ежей, в промоторной последовательности которого обнаружен участок UAS (Delgadillo-Reynoso et al., 1989). Известно, что ЭФР участвует в формировании как эктодермальных, так и мезодермальных тканей (Schuldiner, Benvenisty, 2003). Хотя не исключено, что мишенями могут оказаться другие гены.

Эмбрионы с ОПС, сформировавшиеся в результате агробактериальной трансформации генами rolB (Рис. 9, В) и rolC (Рис. 9, Г) имеют значительные отличия как в строении эмбрионов в целом, так и в структуре опухолеподобных образований. Эмбрионы имеют вытянутую форму, в бластоцеле видны мезенхимные клетки, плотность которых увеличивается в направлении к ОПС. Опухолеподобные структуры, в отличие от трансформированных gal4 эмбрионов, представляют собой группу клеток, локализованную на поверхности эмбрионов без видимых повреждений стенки эмбрионов (Рис. 10, А, Б). Ультраструктурный анализ клеток эктодермы контрольных и трансформированных эмбрионов не выявил различий.

Рис. 8. Полутонкие срезы эмбрионов Scaphechinus mirabilis, обработанных плазмидой pMA563, несущей ген gal4 (60 часов после оплодотворения). А – контрольный эмбрион на стадии раннего плутеуса. Б – эмбрион с ОПС. Окраска метиленовым синим. Линейка 50 мкм.

Рис. 9. Внешний вид эмбрионов с ОПС морского ежа S. intermedius, культивированных совместно с A. tumefaciens спустя 32 часа после оплодотворения. А – внешний вид контрольного эмбриона на стадии поздней гаструлы. Эмбрион из культуры с добавлением штамма A. tumefaciens GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002 (вектор) (Б), с плазмидой pPCV002-rolC (В), с плазмидой pPCV002-rolB (Г). Линейка 45 мкм.

Рис. 10. Полутонкие срезы эмбрионов с ОПС Scaphechinus mirabilis (A) и S.

intermedius (Б), культивированных совместно со штаммами A. tumefaciens GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002-rolB (A) и GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002-rolC (Б). 20 часов совместного культивирования. Окраска метиленовым синим. Линейка 50 мкм.

Также обнаружено значительное морфологическое сходство между клетками вторичной мезенхимы контрольных эмбрионов на стадии поздней гаструлы и клетками ОПС.

Морфологические нарушения эмбриогенеза морских ежей, наблюдаемые в наших экспериментах по агробактериальной трансформации, сходны с нарушениями, которые наблюдали Коффман с коллегами у эмбрионов после блокировки активности гена транскрипционного фактора spRunt, регулирующего экспрессию актинового гена CyIIIa в аборальной эктодерме (Coffman et al., 2004).

Хотя авторы сравнивают эти нарушения с экзогаструлой, тем не менее, они указывают на формирование рудиментарной первичной кишки или на полное отсутствие экзоархентерона. При ингибировании spRunt эмбриональные клетки морских ежей приобретают черты, свойственные раковым клеткам, при этом в эмбрионах наблюдается апоптоз и вторичная эктопическая пролиферация клеток. Это неудивительно, так как гены группы Runx часто функционируют как супрессоры онкогенеза (Coffman, 2003). При анализе клеток в эмбрионах морских ежей на включение БДУ после агробактериальной трансформации мы также обнаружили эктопическое включение метки. Из этого следует, что растительные онкогены, вызывающие процессы неопластической трансформации растительных клеток, не ингибируют пролиферацию эмбриональных клеток морских ежей, но влияют на дифференцировку эмбриональных полей, что приводит к нарушению хода эмбриогенеза.

ВЫВОДЫ 1. Впервые доказан факт агробактериальной трансформации эмбриональных клеток морских ежей в условиях морской среды. Процесс трансформации проходит в ходе совместного культивирования эмбрионов морских ежей с агробактериями и сопровождается формированием контактов между бактериями и эмбриональными клетками при помощи Т-пилей. Визуальный эффект агробактериальной трансформации выражается в появлении у части эмбрионов на поверхности опухолеподобных структур.

2. Использование агробактериальных штаммов, несущих мутантные гены по локусу vir, приводит к снижению числа ОПС у эмбрионов. Это, наравне с формированием контактов при помощи Т-пилей, является доказательством vir-опосредованного механизма переноса Т-ДНК. Помимо этого, наличие границы между последовательностями Т-ДНК и геномной ДНК морских ежей свидетельствует о том, что трансформация идет именно за счет Т-ДНК, а не за счет других участков плазмидной или хромосомной ДНК агробактерий.

3. Впервые показано, что экспрессия генов rolB и rolC приводит к появлению ОПС у эмбрионов морских ежей. Время появления и морфология таких эмбрионов достаточно сильно отличается от эмбрионов с ОПС, трансформированных плазмидной ДНК, несущей ген универсального активатора транскрипции gal4. Нарушение хода эмбриогенеза в обоих случаях связано с ненормальным и чрезмерным развитием клеток мезенхимы. Хотя, вероятно, в случае трансформации геном gal4 и генами rolB и rolC задействованы разные механизмы.

4. Растительные онкогены rolB и rolC влияют на дифференцировку эмбриональных полей. Результатом этого является нарушение хода эмбриогенеза морских ежей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Киселев К.В., Одинцова Н.А., Кольцова Е.А., Булгаков В.П., Яковлев К.В. Влияние активатора транскрипции GAL4 на рост и развитие эмбрионов и эмбриональных клеток в первичных культурах плоского морского ежа (Scaphechinus mirabilis) // Тезисы научной конференции НОЦ ДВГУ «Морская биота» (Владивосток, 2 октября 2002).

Владивосток: изд-во ДВГУ, 2002. С. 82.

2. Киселев К.В., Одинцова Н.А, Булгаков В.П., Кольцова Е.А., Яковлев К.В. Клетки плоских морских ежей как возможные продуценты биологически активных веществ // Вестник ДВО РАН. 2002. № 5. С. 101104.

3. Киселев К.В., Дячук В.А., Яковлев К.В., Одинцова Н.А., Булгаков В.П. Перенос Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens в эмбрионы и клеточные культуры морских ежей // Сборник тезисов 7-ой Международной школыконференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 1418 апреля 2003). Пущино: ПНЦ РАН, 2003. С. 341.

4. Одинцова Н.А., Киселев К.В., Булгаков В.П., Кольцова Е.А., Яковлев К.В. Влияние активатора транскрипции эукариот GAL4 на рост и развитие эмбрионов и эмбриональных клеток в первичных культурах морского ежа Scaphechinus mirabilis // Онтогенез. 2003. Т. 34, № 4. С. 267-272.

5. Одинцова Н.А., Киселев К.В., Дячук В.А., Яковлев К.В., Булгаков В.П. Инициация опухолеподобных структур в эмбрионах морских ежей // Материалы 1-го Всероссийского симпозиума по клеточной биологии (Санкт-Петербург, 14-17 октября 2003). Цитология. 2003. Т. 45, № 9. С.

908-909.

6. Киселев К.В., Дячук В.А., Яковлев К.В., Одинцова Н.А., Булгаков В.П. Экспрессия агробактериальных генов в эмбриональных клетках морских ежей // Сборник тезисов 8-ой Международной школыконференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 1721 мая 2004). Пущино: ПНЦ РАН, 2004. С. 14.

7. Одинцова Н.А., Яковлев К.В., Киселев К.В., Булгаков В.П. Генноинженерная регуляция дифференциации и пролиферации эмбриональных клеток морских ежей // Тезисы Международного научного семинара «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2-4 ноября 2004). Мурманск: ММБИ КНЦ РАН, 2004. С. 9395.

8. Яковлев К.В., Одинцова Н.А., Киселев К.В., Булгаков В.П.

Взаимодействие Agrobacterium tumefaciens с клетками морских ежей, сопровождающееся переносом Т-ДНК и нарушением эмбрионального развития морских ежей // Тезисы Международного научного семинара «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2-4 ноября 2004). Мурманск: ММБИ КНЦ РАН, 2004. С. 149150.

9. Bulgakov V.P., Kiselev K.V., Yakovlev K.V., Zhuravlev Y.N., Gontcharov A.A., Odintsova N.A. Agrobacterium-mediated transformation of sea urchin embryos // Biotechnology Journal. 2006. Vol. 1. P. 447-453.

10. Яковлев К.В. Одинцова Н.А., Киселев К.В., Булгаков В.П.

Трансформация эмбрионов морских ежей агробактериями // Сборник X Международной молодежной Школы-конференции (МЭС, ТИБОХ, 12-сентября, 2006). Владивосток: ДВО РАН, 2006. С. 54.

11. Одинцова Н.А., Яковлев К.В., Дячук В.А. Регуляция процессов роста и дифференцировки клеток морских беспозвоночных в культуре // Материалы Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 17-19 октября, 2006). Цитология. Т 48, № 9. С. 785-786.

12. Одинцова Н.А., Яковлев К.В., Дячук В.А. Культуры клеток морских беспозвоночных: проблемы, успехи, перспективы // Сборник тезисов Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании – 2006» (Калининград, 18-20 октября, 2006). Калининград:

изд-во КГТУ, 2002. С. 50-52.

Константин Владимирович ЯКОВЛЕВ АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭМБРИОНОВ МОРСКИХ ЕЖЕЙ И НАРУШЕНИЕ ХОДА ЭМБРИОГЕНЕЗА ПРИ ЭКСПРЕССИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОНКОГЕНОВ rolB И rolC АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»