WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Жизнеспособность агробактерий в морской воде и формирование контактов между агробактериями и эмбрионами морских ежей Возможность агробактериальной трансформации в условиях повышенной солености напрямую связана с изучением вопроса о жизнеспособности агробактерий в морской воде и способности клеток последних нормально размножаться в этой среде. В данной работе мы проверяли жизнеспособность агробактерий A. tumefaciens GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002-rolC в чистой морской воде и в совместной культуре с эмбрионами морских ежей. В течение 5 дней агробактерии остаются живыми в морской воде, но их количество постепенно уменьшается. Однако, при культивировании с живыми эмбрионами количество агробактерий сильно возрастает, что приводит к гибели эмбрионов на 2-3 сутки совместного культивирования.

Другая сторона вопроса об агробактериальном переносе в морской воде связана с рассмотрением возможности формирования первичных контактов, активации vir-региона и сборки аппарата пилей для осуществления контактов между агробактериями и клетками-реципиентами с последующей передачей Т-ДНК. Нам удалось обнаружить нитевидные контакты между бактериями и клетками морских ежей на 2-3 сутки совместного культивирования (Рис. 1, А). Диаметр нитей составил около нм. Исходя из этого, можно предположить, что контакт сформирован агробактериальными Т-пилями, так как, согласно данным Лаи с соавторами, диаметр пилей агробактерий составляет 10 нм (Lai et al., 2000).

Формирование Т-пилей наблюдается также у бактерий, которые не контактируют с клетками морских ежей (Рис. 1, Б). Это говорит об активации vir-региона агробактерий в культуре при совместном культивировании с эмбрионами.

Встройка Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов и экспрессия растительных онкогенов rolB и rolC Помимо встройки Т-ДНК в геномную ДНК клетки-реципиента главным критерием успешного исхода агробактериальной трансформации служит экспрессия локализованных в Т-ДНК генов. Использованные нами в экспериментах штаммы A. tumefaciens несут гены rolB и rolC родственной агробактерии A. rhizogenes. Векторы, содержащиеся в штамме GV3101(pMP90RK), являются конструкциями, разработанными для растений. Однако гены rolB и rolC под промоторами вируса мозаики цветной капусты 35S и нопалинсинтазным промотором nos, исходя из литературных данных, могут быть активными в клетках животных. Экспрессия генов под данными промоторами и их распознавание, как и распознавание растительных сигналов полиаденилирования, отмечены для ооцитов лягушки ксенопуса (Ballas et al., 1989). Кроме того, показано, что nos промотор активен и в клетках млекопитающих (Zahm et al., 1989). Для проверки экспрессии растительных онкогенов rol мы провели ОТ ПЦР анализ. В качестве контрольной реакции ОТ ПЦР мы определяли экспрессию гена актина морского ежа CyIIb (экспрессия в оральной эктодерме и ротовой области) (Рис. 2).

Экспрессия генов rolB, rolC и nptII отмечается у эмбрионов морских ежей после совместного культивирования с агробактериями (Рис. 3, линии 1, 5, 6, 7). Анализ последовательностей ПЦР-продуктов показал 100% гомологию с генами rolB и rolC (GenBank, Ac. No. K03313) и геном неомицинфосфотрансферазы nptII (GenBank, Ac. No. AJ414108).

Рис. 1. A. tumefaciens в культуре с эмбрионами морских ежей (3 суток совместного культивирования). А – контакт между агробактерией и клеткой морского ежа, Б – единичная бактерия. Линейка 200 нм.

Рис. 2. Экспрессия гена актина CyIIb эмбрионов морских ежей S. nudus на стадии гаструлы. P – позитивный контроль (ПЦР с кДНК), N – негативный контроль (ПЦР с РНК), М – молекулярный маркер с шагом 100 п.н.

Рис. 3. Выявление транскрипции генов rol и nptII в эмбрионах морских ежей после совместного культивирования с A. tumefaciens методом ОТ ПЦР.

N – негативный контроль (кДНК нетрансформированных эмбрионов); P – позитивный контроль, амплификация с плазмидой pPCV002-rolABC; эмбрионы, трансформированные штаммами с плазмидами: 1 – pPCV002-rolC, 2 – pPCV002rolC + мутантный virA (pTi237), 3 – pPCV002-rolC + мутантный локус virB (pTi243), 4 – pPCV002-rolC + мутантный virG (pTi19), 5 – pPCV002-rolB, 6 – транскрипция nptII в трансформированных pPCV002-rolB эмбрионах, 7 – транскрипция nptII в трансформированных pPCV002-rolC эмбрионах, M – молекулярный маркер с шагом 100 п.н.

При использовании агробактериальных штаммов, несущих мутантные гены vir (virA, virB, virG), экспрессию генов rol и nptII не наблюдали (Рис. 3, линии 2, 3, 4). Эти данные подтверждают результаты ПЦР-анализа. При использовании штаммов, мутантных по генам vir, не обнаружено присутствия генов rol и nptII в эмбрионах морских ежей. Из этого следует, что при передаче Т-ДНК задействован vir-опосредованный механизм переноса.

Для доказательства встройки Т-ДНК мы использовали метод TAILПЦР. Этот метод позволяет амплифицировать участок ДНК, где произошла сшивка чужеродной и геномной ДНК, с использованием специфического и вырожденного (рэндом) праймеров. Для доказательства встройки мы выбрали участок Т-ДНК, прилегающий к правому бордеру. После трех амплификаций (Рис. 4, А) ПЦР-продукт был клонирован и секвенирован.

Точная масса ампликона составила 161 п.н., из которых 34 п.н. приходились на фрагмент, прилегающий к правому бордеру участка Т-ДНК, 2 п.н. – на остаток бордера и 125 п.н. – предположительно, на последовательность ДНК морского ежа (Рис. 4, А, Б). Анализ фрагмента величиной 125 п.н. не показал гомологии с последовательностью плазмиды pPCV002-rol, поэтому мы предполагаем, что данная последовательность является последовательностью ДНК морского ежа. К сожалению, гомологии на данный участок среди известных последовательностей ДНК морского ежа S. purpuratus (GenBank) не было обнаружено. Это дает основание предположить, что встройка Т-ДНК произошла в видоспецифическую неконсервативную последовательность.

Наличие границы, где прошла сшивка при встраивании между Т-ДНК и геномной ДНК морских ежей, опровергает вероятный ненаправленный путь трансформации путем захвата эмбриональными клетками плазмидной ДНК из разрушенных бактериальных клеток и свидетельствует о нормальном протекании процесса агробактериальной трансформации, который является единым для животных и растительных клеток.

Появление и возможные причины формирования опухолеподобных структур (ОПС) у эмбрионов морских ежей В ходе совместного культивирования агробактерий A. tumefaciens, несущих растительные онкогены rolB и rolC, у части эмбрионов наблюдается формирование опухолеподобных структур – такие структуры представлены неоформленными скоплениями клеток на поверхности эмбрионов и получили название вследствие их внешнего вида.

Рис. 4. Клонирование последовательности, содержащей сшивку Т-ДНК A.

tumefaciens и геномной ДНК S. intermedius. A – схема проведения TAIL-ПЦР. На схеме представлены три последовательные амплификации. Часть Т-ДНК, прилегающая к правому бордеру (черный сегмент), отображена белым цветом, геномная ДНК S. intermedius представлена серым сегментом. Б – выравнивание нуклеотидной последовательности участка плазмиды pPCV002-rolC, несущего прилегающие к правому бордеру области, и клонированной нуклеотидной последовательности в месте соединения Т-ДНК с геномной ДНК S. intermedius.

Рис. 5. Число эмбрионов S. nudus с опухолеподобными структурами при трансформации плазмидами, несущими гены gal4 (58-59 часов после оплодотворения), rolB и rolC (24-29 часов после оплодотворения).

Ранее ОПС были описаны у трансформированных геном gal4 эмбрионов морских ежей. В связи с этим, мы, наряду с агробактериальной трансформацией, проводили ПЭГ-опосредованную трансформацию плазмидами, несущими ген gal4 или растительные онкогены rolB и rolC, для сравнения количества эмбрионов с ОПС, а также для сравнительного анализа морфологии опухолеподобных структур.

Эксперименты по ПЭГ-опосредованной трансформации плазмидной ДНК (Рис. 5), несущей либо ген gal4, либо растительные онкогены rolB или rolC, показали, что процент эмбрионов с ОПС находится на одном уровне (35,5 %). Такого рода сходство говорит о высокой эффективности ПЭГопосредованной трансформации. Количество эмбрионов с ОПС при трансфекции геном gal4 в процентном соотношении составляет 3,6±0,5%. В этом случае опухолеподобные структуры наблюдали на 3 сутки после оплодотворения. Эффект растительных онкогенов rolB и rolC проявляется уже к концу первых суток, содержание эмбрионов с ОПС при этом составляет 4,5±0,75% для гена rolC и 3,8±0,6% для rolB. В контрольной культуре эмбрионов наблюдали небольшой процент (в среднем 0,82±0,15%) эмбрионов с ОПС, по-видимому, это связано с нарушением хода эмбриогенеза у части эмбрионов. При обработке ПЭГ 4000 Да и плазмидой pPCV002 процент ОПС несколько возрастает (1,65±0,15%). Незначительное увеличение процента ОПС можно объяснить токсическим эффектом ПЭГ.

Увеличение количества ОПС при трансформации pPCV002 (2±0,38%), вероятнее всего, связано со встройкой чужеродной ДНК в геномную ДНК морских ежей, что может приводить к сбою программы развития вследствие инактивации генов или их неконтролируемой активности.

Результаты агробактериальной трансформации, которую проводили путем совместного культивирования A. tumefaciens с эмбрионами морских ежей трех видов, представлены на рисунке 6. Максимальное количество эмбрионов с ОПС наблюдали через 20-24 часа у Scaphechinus mirabilis и через 24-28 часов у S. nudus и S. intermedius. После этого количество эмбрионов с такими аномалиями развития сокращалось, но в культуре появлялось большое количество одиночных клеток. По-видимому, спустя какое-то время происходил распад эмбрионов с ОПС на клетки. Подводя итог, можно сказать, что при совместном культивировании со штаммом агробактерий GV3101(pMP90RK), несущих плазмиду pPCV002, количество эмбрионов с ОПС варьировало в пределах 1-3%. Процентное содержание в культуре эмбрионов с ОПС составило 4-8% для pPCV002-rolC и 4,5-14% для pPCV002-rolB. При сравнении количества эмбрионов с ОПС при агробактериальной и ПЭГ-опосредованной трансформациях оказалось, что при совместном культивировании эмбрионов морских ежей с A. tumefaciens процент ОПС выше. Кроме того, увеличение числа таких эмбрионов практически не зависит от присутствия бактерий в культуре, так как относительное количество эмбрионов с ОПС при культивировании со штаммом GV3101(pMP90RK), который не несет гены rol, находится на уровне обработанной ПЭГ эмбриональной культуры. Процент эмбрионов морских ежей с ОПС при агробактериальной трансформации генами rolB и rolC, различается у трех видов морских ежей: Scaphechinus mirabilis, S.

intermedius и S. nudus, но достоверное увеличение числа ОПС при использовании конструкций с генами rolB и rolC говорит о влиянии растительных онкогенов на ход эмбриогенеза у всех трех видов.

Для того, чтобы проверить, связано ли появление опухолеподобных структур с трансформацией эмбрионов агробактериальной Т-ДНК, а также, идет ли перенос ДНК по vir-опосредованному механизму, мы провели ряд экспериментов по совместному культивированию эмбрионов с штаммами A.

tumefaciens, несущими бинарные векторы с мутантными генами virA, virG и мутацией в локусе virB. Использованные мутантные гены приводят к потере функций кодируемых белков (Stachel, Nester, 1986).

В таблице 1 приведены данные, показывающие снижение количества эмбрионов с ОПС при совместном культивировании со штаммами, несущими бинарные векторы с мутантными генами vir. Процент эмбрионов с ОПС при этом такой же, как и при использовании штаммов с бинарным вектором без генов rol. Этот факт указывает на то, что формирование опухолеподобных структур у эмбрионов связано с интеграцией гена rolC в геномную ДНК морских ежей и что трансформация клеток эмбрионов морских ежей идет по vir-опосредованному механизму, по которому происходит агробактериальный перенос Т-ДНК в растительные клетки. Более того, это говорит о влиянии растительных онкогенов rolB и rolC на ход эмбриогенеза морских ежей. Таким образом, активность растительных онкогенов rolB и rolC способна влиять на судьбу эмбриональных клеток морских ежей. К сожалению, на сегодняшний день функции генов rolB и rolC до конца не ясны. Известно лишь то, что белок RolB обладает тирозинфосфатазной активностью (Filippini et al., 1996).

Рис. 6. Число эмбрионов с опухолеподобными структурами (%) у разных видов морских ежей. А – Scaphechinus mirabilis; Б – S. intermedius; В – S. nudus.

Эмбрионов культивировали совместно с A. tumefaciens GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002 (вектор), GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002-rolC (rolC), GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002-rolB (rolB) в течение 24-28 часов.

Одна из других наиболее вероятных причин нарушения хода эмбриогенеза морских ежей – это изменение pH морской воды. При неизменности других параметров окружающей среды, определенное значение pH является фактором, обуславливающим нормальное протекание физиологических процессов в организме, в том числе и в зародыше. Значение pH может варьировать в некоторых пределах, при этом жизнеспособность и физиологические процессы клеток будут протекать нормально. Также известно, что изменение pH морской воды значительно влияет на ход эмбриогенеза морских ежей: снижение значения pH ниже оптимума на 0,20,5 может приводить к дефектам развития (Pagano et al., 1985), хотя обычно pH морской воды варьирует в диапазоне 8,0-8,2. При совместном культивировании эмбрионов морских ежей и A. tumefaciens pH морской воды меняется, но эти изменения незначительные (в течение трех суток от 8,15 до 7,8-8) и больше связаны с жизнедеятельностью эмбрионов. Несомненно, добавление агробактерий в морскую воду с эмбрионами вызывает небольшое уменьшение значения pH на 0,1-0,35. Однако, такое незначительное изменение pH не может отразиться на процессах эмбриогенеза и тем более не может приводить к гибели эмбрионов на третьи сутки.

Внешний вид и строение опухолеподобных структур Как уже ранее упоминалось, опухолеподобные структуры у эмбрионов морских ежей располагаются на поверхности и представляют собой неоформленные группы клеток. При сравнении эмбрионов с ОПС, трансформированных генами gal4, либо rolC или rolB были выявлены морфологические различия. Во-первых, трансформированные gal4 эмбрионы с опухолеподобными структурами имеют округлую форму, ОПС также округлые (Рис. 7, Б, В), иногда красного цвета. Это говорит о наличии в клетках эхинохрома – пигмента, который на ранних эмбриональных стадиях синтезируется пигментными клетками, берущими начало от вторичной мезенхимы. Второй немаловажный момент – время появления опухолеподобных структур. При транcформации геном gal4 ОПС наблюдаются на 2-3 сутки с момента оплодотворения. Контрольные эмбрионы в это время находятся на стадии 4-рукого плутеуса (Рис. 7, А).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»